内毒素血症是临床上一类危重症,它的发病是由于血中或病灶内细菌释放出大量内毒素到血液中引起的一种病理生理表现。内毒素是革兰氏阴性杆菌细胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)成分,主要由脂质A(lipid A)和多糖链组成。它可以引发宿主的天然免疫应答并累及多种器官,如心脏、肾脏、脑和肝脏,引起发热、出血、休克和多器官功能衰竭等症状。尽管临床一直采取大剂量抗菌药物治疗的方法,但该病死亡率仍高达30-50%,是临床危重患者的重要死因之一。过去十几年中陆续开发的新治疗方法,如使用肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和白细胞介素(interleukin)拮抗剂等,并未取得满意效果,因此,研究内毒素血症发病过程中的分子机制可能为临床治疗提供理论基础和现实依据。炎症的细胞因子理论认为,机体内细胞因子分泌的不均衡是导致炎症发生发展的重要因素。正常情况下,细胞因子的分泌维持在一个正常低水平,这有利于维护机体的健康状态；病理情况下,细胞因子水平异常增高,会导致脏器衰竭、休克和组织损伤。内毒素血症时,机体在LPS刺激下,会释放出大量的细胞因子,包括TNF、IL-6和高迁移率族蛋白B1 (High mobility group protein 1, HMGB1)等,这些细胞因子作用于单核巨噬细胞系统,诱发效应细胞释放炎症介质,参与炎症的病理生理过程。在单核巨噬细胞中,S100A8蛋白占到其胞质蛋白总量的40%,这一数量众多的蛋白在单核巨噬细胞系统的作用发挥中承担什么样的角色?在炎症中的转录调控机制如何?这些都是有待回答的问题。S100家族是一类低分子量(10-14KD)的酸性蛋白质。1963年,Moore等从牛脑组织中提取出一种蛋白复合物,因其能够溶于100%饱和的硫酸胺溶液,故取名为S100,S即指可溶性(solubility)。该家族的大部分成员都包含了两个EF手型结构域,并且和金属二价阳离子有不同的亲和力。其结构中铰链区和C-末端序列是该家族发挥功能的关键所在。大部分的S100家族的成员都定位在鼠3号染色体或人类的1q21号染色体上。迄今为止,超过20个S100家族成员被鉴定出来,它们在特异性的组织和细胞中表达。尽管S100家族蛋白缺乏经典的经内质网／高尔基体分泌的氨基酸序列,但是它们中的很多成员都具有细胞外功能,包括参与蛋白的磷酸化、细胞周期的调控、细胞的分化、细胞的迁移和细胞-细胞／细胞-基质的相互作用等。鼠的S100钙结合蛋白A8(S100 calcium-binding protein A8, S100A8),又叫CP-10,最初是在鼠的脾脏细胞中分离得到的。该基因的cDNA序列包括一个267bp的开放读码框(opening read frame, ORF)和42bp的5’侧翼及67bp的3’侧翼序列。尽管人和鼠的S100A8 DNA序列和氨基酸序列上仅仅只有69%和58%相似性,但是人S100A8蛋白却是人S100A8家族中与鼠S100A8最有关联的蛋白。已有的研究表明,S100A8在胚胎发生、先天性免疫反应和慢性炎症反应中发挥着重要的作用。和人类S100A8相比,鼠的S100A8在中性粒细胞中是组成型表达,而在巨噬细胞和单核细胞内,S100A8能够被LPS、肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor, TNFα)、干扰素(interferon, IFN)和白介素-1(interleukin-1, IL-1)等诱导表达。由IFN诱导的鼠巨噬细胞S100A8表达快,在12小时表达到顶峰,而TNF引起的效应则要慢些并且持续更长时间。有趣的是,有些促炎症介质不能诱导S100A8表达,Interleukin-4(IL-4)和Interleukin-13(IL-13)甚至抑制该基因的表达。有实验对LPS诱导的S100A8的机制进行了研究,结果显示LPS诱导鼠巨噬细胞表达S100A8发生在诱导晚期,且这种诱导可以被IL-10抗体所中和,尽IL-10并不直接诱导S100A8的产生。另有研究表明,LPS诱导巨噬细胞S100A8表达上调是通过钙依赖的蛋白激酶C(calcium dependent protein kinase C, PKC)来介导的。在钙离子存在的情况下,S100A8可以与S100钙结合蛋白A9(S100calcium-binding protein A9, S100A9)形成异源二聚体,有研究认为S100A8／A9是某些炎症发生时的标志物。很多自身免疫性疾病和动脉硬化疾病中都发现了S100A8／A9表达阳性的巨噬细胞,它们在内皮细胞和成纤维细胞中也可以诱导表达。最近,还有研究表明它们的表达和某些肿瘤的发生发展相关,该蛋白二聚体还被定义为“损伤相关的模式分子”。有实验表明,该复合物具有抗菌、诱导某些细胞凋亡的作用。在鼠骨髓来源的巨噬细胞中,可以诱导基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP2)、基质金属蛋白酶3 (matrix metalloproteinase3, MMP3)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP9)特别是基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13, MMP13)产生,提示S100蛋白家族可以介导巨噬细胞迁移和基质降解。尽管S100A8／A9复合物是其发挥功能的主要形式,但是有文献报道称单独的S100A8蛋白或S100A9蛋白也具有独立的功能。有研究表明,LPS诱导S100A8基因表达是通过Toll样受体4(toll-like recptor 4, TLR-4)介导,并且依赖环氧化酶2(cyclooxygenase 2, COX-2)。LPS诱导S100A8上调是通过p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)和细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinase, ERK)信号通路。还有研究表明,LPS诱导巨噬细胞中S100A8的表达依赖于新的蛋白合成,而TNF和IFN却不依赖,这些都提示在炎症反应中涉及了不同转录调节方式。尽管S100A8在炎症中的作用很重要,但是对于LPS诱导S100A8的转录调控机制还未完全了解。真核生物基因表达是一个高度复杂、精确调控的过程。基因调控可以发生在复制、转录、转录后等各个环节,但转录起始是基因表达调控最关键的步骤,即在一定时间、空间特异性的基础上的反式作用因子和顺式作用原件的相互作用,也就是,转录起始是由基因的启动子与调节蛋白相互作用来决定的,其实质是DNA-蛋白质／蛋白质-蛋白质间的相互作用对RNA聚合酶活性的影响。另外,人们发现,在基因表达调控过程中,往往不是单个因素起作用,而是多种调节因素相互交织,相互影响,形成复杂的调控网络,最终使基因表达调控呈现出一种高度的有序性。鉴于这种广泛的蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA相互作用网络参与其中,相关研究策略也层出不穷。其中,启动子DNA结合蛋白的研究是从转录水平上研究基因表达的调控,以寻找新的转录调节蛋白质为手段,以了解其转录调节作用机制为目的,为最终阐明某些疾病的发病机制及基因治疗打下基础。目前对启动子DNA结合蛋白的研究方法可分为两大类。第一类是细胞内方法,以已知的启动子DNA序列筛选与其相结合的蛋白编码基因,通过生物信息学分析来确定该蛋白质。细胞内筛选的方法更符合生理状态,且操作简便,适合高通量筛选来寻找未知基因及蛋白质。但此类方法也存在两种缺陷：一是只能筛选与启动子DNA特异性结合的蛋白,但不能检查出精确的蛋白质结合位点；二是特异性需要进一步验证。这类方法包括酵母单杂交技术、噬菌体表面展示技术等。第二类是细胞外法,即在体外用重组的已知蛋白质与启动子DNA结合。该法特异性好,并且能够在启动子DNA序列上找到精确的蛋白质结合位点。这类方法包括凝胶阻滞实验、DNaseI足迹试验等。但这种方法效率低、操作复杂,一般不用于寻找未知基因及蛋白质。我们以细胞外法为基础,将以上两种方法结合应用,以期达到既能找到未知调控蛋白,又能够找到该蛋白质的精确结合位点并证实二者结合特异性的目的。本研究基于DNA-蛋白质相互作用的原理,利用生物素-链霉亲和素系统,采用磁珠分离技术,结合生物质谱鉴定了内毒素血症小鼠S100A8启动子结合差异蛋白,以期寻找LPS刺激下,参与调节S100A8基因转录表达的转录调节蛋白,为深入理解LPS诱导S100A8基因表达的调控机制奠定理论基础。木课题研究包括以下几个方面：(一)小鼠S100A8启动子的生物信息学分析应用在线数据库Transcriptional Regulatory Element Database(TRED)确定小鼠S100A8基因的转录起始位点,并获取转录起始位点上游826bp与下游468bp的DNA片段。将获得的DNA片段在NCBI/BLAST上进行核苷酸序列比对,并在Ensemble上与S100A8基因的5’侧翼序列进行比对,两者比对结果均是100%匹配。应用在线Consite系统对获取DNA片段潜在的转录因子结合位点进行预测,确定S100A8基因转录起点上游826 bp至下游468 bp的启动子序列作为本实验的研究对象。(二)小鼠S100A8启动子的克隆及其活性检测提取小鼠脾组织基因组DNA, PCR扩增小鼠S100A8启动子序列(-826-+468)；构建由S100A8启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRedl-1-S100A8p,测序鉴定其构建正确后,将该载体瞬时转染小鼠巨噬细胞胞株RAW264.7,荧光／活细胞成像显微镜下观察静息、NaAsO2、LPS和PolyI:C刺激下红色荧光蛋白表达,以检测此段S100A8启动子的活性。结果证实,此段启动子在静息状态下即具有转录活性,炎性、氧化应激等刺激后其转录活性增强。该段启动子的成功克隆为下一步研究S100A8基因转录调控提供了载体。(三)内毒素血症小鼠S100A8启动子差异蛋白的筛选利用末端生物素(biotin)标记的S100A8启动子引物,PCR扩增S100A8启动子探针(biotin-S100A8)。BALB/c小鼠以20 mg/kg腹腔注射LPS后6h,提取肝脏组织核蛋白。将肝脏组织核蛋白与biotin-S100A8探针结合,再用标记有链霉亲和素(streptavidin)的磁珠分离biotin-S100A8-蛋白反应复合物,最后用DIGE样品裂解缓冲液洗脱磁珠上结合的蛋白。将此S100A8启动子结合蛋白洗脱液进行荧光差异双向凝胶电泳(2-D difference gel electrophoresis,2-D DIGE)。经过DeCyder软件分析,找到29个差异蛋白点,其中上调的25个,下调为4个。(四)内毒素血症小鼠S100A8启动子结合差异蛋白的质谱鉴定质谱鉴定前,对差异蛋白样品进行胰酶消化等多步处理后,将样品靶输入ABI4800 MALDI-TOF/TOF质谱仪中,获取肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprinting,PMF),采用MS和MS/MS联合模式搜索Swiss-Prot数据库,质谱鉴定出19个蛋白质,其中上调蛋白17个,下调蛋白2个。查阅文献对质谱鉴定出的蛋白的基本功能进行分析,已经有文献报导参与基因转录调节过程蛋白有4个,分别是：核不均一核糖核蛋白A2/B1 (heterogeneous nuclea rribonucleo protein A2/B1, hnRNPA2/B1),核心组蛋白H2A(Core histone marco-H2A),共转录因子HES-6(Transcription cofactor HES-6),甲基化酶样蛋白4(Methyltransferase-like protein 4, MT-4)。(五)差异蛋白质的生物信息学分析应用WoLF PSORT蛋白定位预测软件并参考NCBI及Swiss-Prot数据库关于蛋白亚细胞定位信息对差异蛋白亚细胞定位进行综合分析。结果如下：完全定位于细胞核的蛋白有6个；既可定位于细胞核内,又可定位于其它多个亚细胞结构的有8个；在其它亚细胞结构定位,但不定位于细胞核内的有5个。以上结果表明,本实验所筛选的差异蛋白有部分核定位,这些生理或病理条件下能定位于细胞核的蛋白更可能参与S100A8的转录调控。运用String软件对鉴定的差异蛋白进行一级相互作用预测,结果发现这19个蛋白之间并无直接的相互作用,提示,它们在LPS刺激后S100A8的转录过程中有可能是单独发挥作用或者是间接的和第三方蛋白质形成复合体从而发挥作用。通过以上研究,我们得出以下结论：1.本实验所克隆的S100A8启动子(-826～+468)具有启动S100A8基因转录活性,炎性或氧化刺激能增强其活性。2.从活体肝组织胞核蛋白提取物中筛选并且质谱鉴定出4个可能参与LPS诱导的S100A8基因转录调控的蛋白,其中包括核不均一核糖核蛋白A2／B1、核心组蛋白H2A、共转录因子HES-6、甲基化酶样蛋白4。本研究基于DNA-蛋白质相互作用的原理,利用生物素-链霉亲和素系统从活体组织进行S100A8启动子结合蛋白的筛选,为从“转录调控组学”的角度研究基因转录调控过程及机制开创了新的思路。同时本实验将生物素-链霉亲和素系统、磁珠分离技术与DIGE及质谱技术相结合,实现了转录调控研究技术和最新的差异蛋白质组研究技术的对接,为成功、高效地筛选和鉴定DNA结合蛋白提供了新途径。本实验所筛选和鉴定出的内毒素血症小鼠S100A8启动子结合差异蛋白,对于我们深入理解LPS诱导S100A8基因表达调控机制具有重要意义,同时也将为临床内毒素血症的治疗提供新的理论依据。