【摘 要】
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该论文分为两部分,第一部分为纳豆激酶液体发酵过程的优化,第二部分为层析法分离纯化P450.纳豆激酶(Nattokinase,NK)是从日本传统食品纳豆发现的一种具有纤溶活性的酶.该论文考察了在种子瓶加入木糖对发酵过程的影响,1g·L的木糖能缩短产纳豆激酶(NK)菌株(Bacillus subtilis HL-1)的延滞期,使纳豆激酶的酶活从1314 IU·mL提高到1698 IU·mL,接着在3.
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该论文分为两部分,第一部分为纳豆激酶液体发酵过程的优化,第二部分为层析法分离纯化P450<,BM-3>.纳豆激酶(Nattokinase,NK)是从日本传统食品纳豆发现的一种具有纤溶活性的酶.该论文考察了在种子瓶加入木糖对发酵过程的影响,1g·L<-1>的木糖能缩短产纳豆激酶(NK)菌株(Bacillus subtilis HL-1)的延滞期,使纳豆激酶的酶活从1314 IU·mL<-1>提高到1698 IU·mL<-1>,接着在3.7升Bioengineering KLF2000型发酵罐进行培养,研究发现菌浓和溶氧是影响菌体产酶的重要因素,利用在稳定期维持溶氧在30％~40％之间,在菌浓下降时进行分批补料,最终发酵液中纳豆激酶的酶活由摇瓶时的1314 IU·mL<-1>提高到在3.7升发酵罐中的2348 IU·mL<-1>.细胞色素P450<,BM-3>是从Bacillus megaterium中分离出来的一种单加氧酶,它能催化长链脂肪酸(C<,12>-C<,20>)ω-羟化以及非饱和长链脂肪酸的羟化或环氧化,其基因已经被克隆并在大肠杆菌中有效表达.该论文主要工作是将已构建好的表达P450<,BM-3>的质粒转入大肠杆菌DH5α中,对其发酵条件进行了优化,并通过层析方法有效地分离提纯P450<,BM-3>酶.通过对该实验室已经存在疏水介质的筛选表明,Source 15ISO与Phenyl Sepharose High Performance能较好地吸附目标蛋白P450<,BM-3>,对Source 15ISO吸附目标蛋白P450<,BM-3>的条件进行了一些优化,确定1.0 M(NH<,4>)<,2>S0<,4>,pH7~8的缓冲液作为上样缓冲液,洗脱时梯度长度为4~5CV,流速为1mL/min的条件,可以较好地分离目标蛋白P450<,BM-3>.Phenyl Sepharose High Performance当全部用10mM PBS洗脱缓冲液洗脱时,目标蛋白才能被洗下来.确定了以下分离纯化路径:发酵液离心收集菌体→细胞破碎离心收集上清液→35％~70％饱和硫酸铵分级沉淀→上样缓冲液溶解沉淀→Source 15ISO疏水层析→Sephacryl S-200凝胶层析,纯化倍数13.5,酶活收率13.7％.
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