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免疫检查点是在人体内免疫调控过程中的可以下调免疫效应细胞激活反应的关键因子,而PD-1正是T细胞上的重要免疫点之一。肿瘤细胞通过在其细胞膜表面高表达PD-L1与T细胞表面的PD-1结合,向吞噬细胞发出“Do not eat me”的信号,从而促进抗原特异性T细胞的凋亡,减少调节性T细胞的凋亡,最终实现免疫逃逸。阻断型抗体是通过阻断PD-1、PD-L1之间的信号传递,减少调节性T细胞的凋亡,从而增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。本研究以获取PD-1、PD-L1单克隆抗体为目的,通过病毒免疫技术、杂交瘤技术、全合成人源抗体库筛选技术等,获得了可以特异性识别PD-1蛋白的单克隆抗体4G9及PD-L1蛋白的单克隆抗体1A7。首先,通过病毒包装的方式,产生滴度为1×106TU/mL PD-1慢病毒颗粒。同时利用大肠杆菌表达系统制备浓度为0.54mg/mL,纯度>85%的PD-1ECD重组蛋白用于接下来的抗体检测实验。利用病毒颗粒感染小鼠,已达到抗原免疫的效果,其效价大于1:2.6×107。接着利用细胞融合技术获取7株可以产生特异性抗体的杂交瘤细胞,经过三次克隆化后得到与抗原结合能力最强且可以稳定分泌特异性识别PD-1的单克隆抗体4G9,并对其进行体外检测。经鉴定4G9单抗属于IgG2a、κ亚型。通过小鼠腹水制备的方法大量制备抗体随后经Western-Blot检测其特异性,其纯化后腹水与抗原亲和力常数为5.15×108L/mol。利用间接ELISA的方法检测反复冻存后细胞结合能力,结果表明4G9细胞株可以稳定分泌抗PD-1蛋白的单克隆抗体。基于以上鉴定结果,4G9是一株具有良好特异性结合能力的单抗细胞株。其次,利用大肠杆菌表达系统制备得到浓度为1.05mg/mL,纯度>95%的PD-L1ECD重组蛋白。以PD-L1胞外区重组蛋白为抗原,对全合成人源抗体库进行筛选。得到一个结合能力较强的单链抗体1A7。通过分子克隆手段将其构建为全抗表达载体。利用FreeStyle TM293-F表达系统对其进行表达与纯化,最终得到可以特异性识别PD-L1胞外区的人源抗体。综上所述,本研究得到的两株单克隆抗体为接下来PD-1、PD-L1单克隆抗体的动物模型药效试验打下基础,为后续研究提供了新型候选分子。