1.研究背景前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)是维持膝关节稳定性重要的结构,损伤后自我愈合能力较差,临床上主要通过手术重建恢复膝关节的稳定性。临床ACL重建术常使用的移植物包括自体移植物、同种异体移植物以及人工韧带。自体移植物是临床首选,尤其是髌韧带中部1/3的骨-膑腱-骨移植物被认为是临床重建的“金标准”；但自体移植物取材有限,并且术后往往发生供区疼痛、愈合时间长、甚至髌腱断裂等供区并发症。同种异体移植物是临床备选材料,但应用时也存在疾病传播、术后感染,宿主的免疫排斥反应等风险,而且来源有限。人工韧带,来源广泛,力学性能卓越,但合成材料无生物活性,无法与宿主完全融合,长期应用,支架材料会发生疲劳断裂。长期疗效不稳定。这些因素都阻碍了自体和同种异体移植物以及人工韧带在临床的广泛应用。因此,亟待寻找一种来源广泛、生物相容性好,免疫原性低、与自体ACL力学相匹配的支架材料。蚕丝是一种天然生物材料。其弹性和强度的优异结合,良好的生物相容性,缓慢的生物降解性,低免疫原性以及易于编织等特性使蚕丝纤维成为较理想的韧带组织工程支架材料。编织的蚕丝支架及蚕丝-蚕丝海绵,蚕丝-Ⅰ型胶原等复合支架近些年被广泛研究,动物体内重建ACL后均达到了较好的重建效果。然而目前这些研究通常以充当细胞外基质主要成分的胶原作为蚕丝支架的修饰物,并未涉及对组织细胞有重要调节作用的细胞因子,而且通过促进支架材料早期血管化来提高重建效果的方法也少有研究。小肠黏膜下层(small intestinal submucosa, SIS)是目前应用最广泛的细胞外基质材料之一,其主要成分为Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原,以及少量的多糖类物质。SIS富含多种生长因子：如血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)等,这些因子在SIS经过处理后仍得以保留,并保持了其生物活性。SIS体内移植后被证实能迅速诱导细胞生长迁移,刺激血管生成,使修复部位早期血管化,在心肌梗死修复和组织工程皮肤,食管,软骨等领域被广泛应用。2.研究目的在组织修复重建过程中,血管可以起到提供氧气和营养、运输代谢产物的作用,因此移植物的早期血管化能力对组织修复意义重大。本研究欲采用富含细胞活性生长因子和Ⅰ型胶原并且体内移植后具有促血管化能力的SIS与力学性能优异的蚕丝支架结合,设计制备SIS-蚕丝复合支架,并评价复合支架的力学性能,生物相容性,以及体内移植后是否具有促进移植物早期血管化进而提高重建效果的潜能。3.研究方法3.1蚕丝支架与SIS-蚕丝复合支架制备将天然蚕丝通过0.02m NaHCO3溶液处理,完全脱去丝胶。参考文献,采用扭转缆绳式设计,通过方程式模型模拟兔自体ACL的力学特性,用计算机蚕丝编织机编织符合兔自体ACL力学特性的蚕丝支架。将膜状SIS呈圆筒状包绕在蚕丝支架外围构建SIS-蚕丝复合支架。3.2支架力学性能评价及表面形貌观察通过生物力学测试仪评价支架的力学性能,通过扫描电镜(SEM)观察支架材料的表面形貌特征。3.3支架材料细胞相容性评价通过活死细胞染色法,观察支架材料对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的影响。通过CCK-8法绘制生长曲线,评价支架材料浸提液对细胞生长的影响。3.4支架组织相容性评价及异位移植早期血管化能力评价30只6周龄SD大鼠随机分为两组,蚕丝支架组(S组)与复合支架组(SS组),分别将两组支架材料移植大鼠皮下,2W、4W、8W取材行HE染色观察,通过计数炎性细胞评价组织相容性,通过统计血管数目和观察支架新生血管的位置分布评价支架的促血管化能力。3.5两支架对关节液渗入胫骨隧道影响的评价20只新西兰大白兔平均分为两组,S组与SS组。行双膝前交叉韧带重建,术中胫骨隧道开窗,5ml 10%NaCl和墨水溶液分别行关节腔内注射,不同时间点测量骨窗内移植腱的电阻值并记录骨窗处墨水渗出时间。3.6重建术后支架移植物表面血管化评价用体式显微镜观察重建术后4W,8W,12W韧带移植物新鲜标本在骨遂道内口和移植物中间段的血管分布情况,评价支架关节内移植后表面早期血管化情况。3.7术后支架移植物韧带化评价重建术后4W,8W,12W,每组处死3只实验动物,取移植物标本行HE和Masson染色观察,评价支架关节内移植后韧带化情况。3.8术后腱骨界面愈合的评价术后4W,8W,12W,每组处死3只实验动物,取股骨-韧带移植物-胫骨复合体标本,通过骨遂道micro-CT扫描观察,评估骨遂道内钙化物质形成状况。扫描完成后标本再通过固定,脱钙处理,获取骨与韧带连接处,通过腱骨界面处HE组织学染色观察,评价腱骨愈合情况。3.9术后移植物复合体力学测试术后4W,8W,12W,取股骨-韧带移植物-胫骨复合体标本,通过生物力学测试机,测试复合体的力学性能,综合评价术后移植物复合体的整体力学性能。4.结果4.1支架材料大体观察处理后获得的SIS为白色富有弹性的膜状材料。蚕丝支架为多股脱胶后蚕丝螺旋编织而成。复合支架内部为螺旋蚕丝束,外围由SIS呈圆筒状包绕。4.2支架力学性能评价及扫描电镜观察蚕丝支架与复合支架最大载荷分别为138.62±11.41N,137.05±16.95N,刚度分别为(24.65±2.62)、(24.21±2.39)N·mm-1,形变量分别为9.40%、10.67%,差异比较均无统计学意义(P>0.05)。复合支架与兔白体韧带的最大载荷匹配,分别为137.05±16.95 N与135.27±20.25 N,(P>0.05),但刚度有差别,分别为24.21±2.39 N/mm与49±15.02 N/mm,(P.<0.05)。SEM示未处理的蚕丝表面凹凸不平,覆盖有大量丝胶。脱胶处理后蚕丝表面光滑,基本无丝胶附着。SIS表面胶原纤维纵横交错排列,胶原间形成大小不一的孔洞。构建的复合支架中间为蚕丝支架,表面由三层膜状SIS包绕而成。4.3支架材料细胞相容性评价活死细胞染色示两种支架材料上细胞形态良好,外形轮廓清晰。其中复合支架上BMSCs申展性更好,并分泌大量细胞外基质。细胞增殖曲线示3组A值均随培养时间延长而升高,呈时间依赖性。各时间点A、B、C 3组A值比较差异均无统计学意义(P>0.05)。4.4两支架对关节液渗入胫骨隧道影响的评价关节腔10%NaCl灌注后SS组电阻值开始下降的时间点明显晚于S组(P<0.05),SS组电阻值拟合曲线的斜率明显小于S组,差异有统计学意义(Z=-2.403,P=0.016)。关节腔内墨水灌注后,SS组墨水未渗出时间及流注时间均较S组明显增长,差异均有统计学意义(P<0.05)。4.5支架组织相容性和体内异位移植后促血管化能力评价皮下埋植标本HE染色示,术后两组支架内均出现炎症细胞浸润,随时间延长炎症反应明显减缓,其中各时间点SS组炎性细胞数明显少于S组(P<0.05)。术后2周SS组支架外缘的SIS开始降解,降解处可见较多新生血管,新生血管管腔小,密度大。术后4周SS组中SIS大量降解,支架中间部分逐渐出现较多新生血管；术后8周血管遍布支架表面和内部,血管变为管腔大的成熟血管。而S组术后各时间点均未见明显新生血管。术后各时间点两组新生血管数比较差异均有统计学意义(P<0.05)。4.6重建术后支架移植物表面血管化评价由体式显微镜观察,术后4周时SS组移植物表面被明显滑膜组织覆盖,靠近骨隧道内口处可见滑膜表面明显的毛细血管网形成；术后8周时见滑膜内有较成熟的血管向移植物的中段延伸；术后12周时均可见管腔粗大的血管贯穿韧带移植物表面。S组在术后4周支架表面未见有明显血管出现；术后8周时移植物表面仅有少量滑膜增生；术后12周时滑膜组织增多,滑膜表面仅有小血管出现。4.7重建术后支架移植物韧带化评价HE染色显示：S组在术后4周时有大量炎性细胞浸润,表面未见明显滑膜组织；术后8周,蚕丝纤维表面有少量滑膜样组织；术后12周时移植物结构紧凑,表面滑膜组织增厚,仍未见明显血管出现。SS组术后4周,移植物结构紧凑,有大量细胞浸润。有三层结构：滑膜组织,未降解的层状SIS,蚕丝纤维结构。术后8周,三层结构变为两层结构,外层滑膜组织明显增厚,滑膜中间弥漫大量新生血管,里层蚕丝纤维致密。术后12周,移植物层次界限模糊,结构致密条理,类似自体韧带样组织。Masson染色示：S组在术后4周时,仅见大量蚕丝纤维,未见明显的胶原纤维；8周时支架中出现稀疏杂乱的胶原纤维；12周时胶原纤维密度增大,但分散、排列不规整。SS组在术后4周时,支架表面有较厚的胶原层,支架内部出现稀疏杂乱的胶原纤维；术后8周时,支架内部出现浓密、排列较规整的胶原纤维,胶原纤维直径较小：术后12周时,支架的层次分界变模糊,内部弥漫大量较成熟且分布致密、排列规则的胶原纤维。4.8术后腱骨界面愈合评价4.8.1组织学评价HE染色示,S组在术后4周时移植物与骨隧道壁之间连接较少；术后8周时界面由肉芽组织填充；术后12周时界面组织中出现致密的纤维连接,沿界面垂直排列,类似sharpey样纤维。SS组在术后4周时,移植物与骨隧道壁之间由致密的肉芽组织填充,中间弥漫大量细胞和新生毛细血管；术后8周时界面中出现浓厚致密的纤维连接,纤维排列规则,沿界面垂直方向排列；术后12周时腱骨界面层次模糊,骨隧道壁出现大量成骨细胞,界面中出现软骨细胞,类似不成熟的腱骨软骨过渡区。4.8.2 micro-CT扫描结果通过分析可知,在重建4周后,SS组与S组骨隧道内均未见明显钙化组织沉积,在重建后12周,两组骨隧道半径未扩大,但骨隧道内仍然未见明显钙化信号。术后4周与12周,骨隧道面积没有明显增大。4.9术后移植物力学评价SS组与S组样本损毁模式差异无统计学意义(p>0.05)。术后4周时,SS组与S组的最大载荷和刚度分别为(40±12.03)、(30±7.91)N和(6.90±1.14)、(5.98±0.81)N/mm,最大载荷与刚度两组间差异无统计学意义(P>0.05)。术后8周时,SS组的最大载荷与刚度均强于S组,最大载荷分别为(45.20±8.44)、(20.20±4.76)N,刚度分别为(5.02±0.84)、(3.36±0.96)N/mm,两组间差异均有统计学意义(P<0.01)。术后12周时,SS组的最大载荷与刚度均强于S组,最大载荷分别为(58±5.70)、(30.6±6.84)N,刚度为(8.12±0.60)、(3.96±0.86)N/mm,两组间差异均有统计学意义(P<0.01)。5.0结论本研究通过促血管化思路设计制备了SIS-蚕丝复合支架。复合支架力学性能优异,细胞和组织相容性好,体内异位移植能早期血管化,并对重建初期胫骨隧道关节液渗入有较好的减缓作用。支架关节内移植后,复合支架早期实现了血管化,韧带化效果好,腱骨连接界面出现软骨细胞过渡区,并且整体力学性能明显优于蚕丝支架。复合支架短期重建效果较好,有望成为一种良好的前交叉韧带重建支架。