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研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率不断升高。随着分子生物学技术的发展，为了进一步指导乳腺癌的诊断、治疗和预后的判断，寻找有效的分子生物学预测指标一直以来都是乳腺癌临床研究的热点。近年来的研究表明，基因表观遗传学的改变对肿瘤发生发展的影响甚至超过基因突变、缺失等遗传学的变化。DNA甲基化是最为常见的一种表观遗传学修饰，异常的DNA甲基化影响基因的转录和表达，可导致抑癌基因沉默或致癌基因活化，从而影响细胞周期的调控、细胞凋亡、DNA修护和细胞粘附等过程。异常的DNA甲基化可发生在恶性肿瘤形成的初始阶段，也可被DNA甲基化抑制剂所逆转，通过改变基因甲基化状态上调特异基因表达有可能成为肿瘤基因治疗的靶点。因而，肿瘤DNA甲基化状态的研究为探索肿瘤发生发展的分子机制开辟了新的途径，也是近年来肿瘤基础研究的热点。目的本研究通过全基因组甲基化芯片技术和表达谱芯片技术检测早期乳腺癌和正常乳腺组织的DNA甲基化及其基因的表达，初步筛选乳腺癌和正常乳腺组织差异性的DNA甲基化表达指标，并探讨DNA甲基化与其基因表达的相互关系，为乳腺癌DNA甲基化研究提供基础数据，也为进一步寻找新的乳腺癌分子标记物和治疗靶点提供理论依据。方法1.收集15例乳腺浸润性导管癌组织（T1N0M0I期7例，T2N0M0IIA期8例）和15例非癌患者的正常组织(乳腺炎2例，乳腺腺病2例，导管内乳头状瘤5例，纤维腺瘤6例)，上述组织标本均经术中和术后病理检查确诊，RNAlater液保存后放入-80℃保藏备用。其中10例乳腺癌组织和正常乳腺组织用于基因芯片的检测，另外5例乳腺癌组织和正常乳腺标本组织用于差异基因的验证。2.本研究采用甲基化CpG岛富集分析(Methylated-CpG Island Recovery Assay，MIRA)联合全基因组甲基化芯片技术对10例早期乳腺癌和正常乳腺标本组织进行检测，初步筛选出乳腺癌和正常乳腺组织差异性的DNA甲基化表达谱；另取独立的5例早期乳腺癌和正常乳腺标本组织，采用亚硫酸氢盐修饰联合直接测序法(Bisulfite Sequencing，BSP)和亚硫酸氢盐修饰联合限制性内切酶分析法（Combined Bisulfite Restriction Analysis，COBRA)对热点的甲基化基因进行验证。3.采用全基因组的基因芯片对10例早期乳腺癌和正常乳腺标本组织进行检测，获得乳腺癌和正常乳腺组织的基因表达谱；结合乳腺癌和正常乳腺组织的差异性的热点甲基化基因，采用逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）方法对热点的基因的表达进行验证。4.通过选择乳腺癌和正常乳腺组织热点的差异性甲基化基因，联合分析DNA甲基化及其基因表达的情况，初步探讨DNA甲基化对基因表达的影响及相互关系。结果1.乳腺癌和正常乳腺组织差异性的DNA甲基化表达谱本研究选择探针信号强度>400，乳腺癌与正常组织的MIRA/Input信号比大于1.2（p<0.01）的探针为阳性，至少2个探针阳性的基因定义为高甲基化基因。研究结果筛选出70个高甲基化，其中甲基化程度最高的5个基因分别是CCND2、PAX6、MNX1、OTX2、PITX2，另外ITGA4、NFIX、OTX2和FGF12首次被报道在乳腺癌组织中异常甲基化。这些差异甲基化基因所涉及的细胞功能主要为细胞生长、细胞周期、细胞分化、细胞凋亡、细胞损伤和修护、细胞转录以及信号通道等。2.热点的甲基化基因的验证为了验证MIRA芯片分析结果的可信度，本研究选择部分热点基因在独立的5例乳腺癌和正常乳腺标本组织进行验证。通过直接亚硫酸盐测序法，发现乳腺癌组织中WT1、PAX6和ITGA4基因的内部，OTX2基因的启动子区域存在分布广泛的甲基化；在乳腺正常组织中同样发现了WT1、OTX2基因的甲基化，但PAX6和ITGA4基因并未发现甲基化。采用COBRA方法检测乳腺癌和乳腺正常组织腺标本中WT1、OTX2、PAX6和ITGA4的甲基化状态，结果显示，在乳腺癌组织中WT1、OTX2和PAX6基因存在明显高甲基化。直接亚硫酸盐测序法和COBRA的结果都验证了DNA甲基化的MIRA芯片分析法的可靠性。3. DNA甲基化与基因表达的相互关系全基因组表达谱芯片分析显示，10例乳腺癌和正常组织之间存在显著性表达差异的基因共有1308个。结合乳腺癌和正常组织差异性的DNA甲基化谱，基因表达芯片检测结果显示一些高甲基化基因的mRNA表达极低，在乳腺癌组织和正常组织中均无表达。而运用RT-PCR对热点基因进行验证的结果显示：WTI和PITX2基因在乳腺癌组织中呈弱表达，在乳腺正常组织中不表达；而OTX2和PAX6基因无论在乳腺癌组织或乳腺正常组织中均不表达。结论1.乳腺癌和正常乳腺组织间存在差异的DNA甲基化谱，提示DNA甲基化可能在乳腺癌的发生发展中起到重要的作用。2. ITGA4，NFIX，OTX2和FGF12等基因首次被证实在乳腺癌组织中高甲基化，可为进一步寻找新的乳腺癌早期诊断分子标记物和治疗靶点提供理论依据。3.乳腺癌DNA甲基化不仅发生在基因的启动子区，也可以发生在基因内部，DNA甲基化发生的位点与基因表达的关系错综复杂，其相互作用仍有待进一步研究。