论文部分内容阅读
目的:柯萨奇病毒B组3型(CVB3)是引起人类病毒性心肌炎的主要病原体之一。目前尚无有效的防治方法可以保护人类免受这一病毒的危害。DNA疫苗的出现为建立有效的免疫预防措施提供了新的思路。根据国内外文献报道,我室选择了能够刺激机体产生保护性抗体的CVB3VP1蛋白作为侯选抗原,构建了pcDNA3-VP1真核表达重组质粒,并进行了免疫效果的观察。结果发现,尽管该DNA疫苗能诱导小鼠产生中和抗体,但仍存在抗体效价低,不能有效保护致死量病毒感染的问题。因此如何增强pcDNA3-VP1的免疫原性,提高其免疫保护率就成为亟待解决的关键问题。近几年来的许多研究表明,联合应用细胞因子可通过不同的环节调节和增强DNA免疫效应,发挥佐剂作用。IL-2是目前应用较广泛的一种细胞因子,对免疫应答具有广泛的上调作用。本研究的目的,就是构建双表达重组质粒pcDNA3/VP1-hIL-2,并观察IL-2基因佐剂对CVB3 VP1所诱导的免疫应答的调节作用,为构建有效预防柯萨奇病毒感染的DNA疫苗奠定实验基础。 方法:利用自行设计的产物,以已成功构建的CVB3病毒VP1基因重组DNA质粒pcDNA3/VP1为模板进行PCR反应,扩增出具有完整真核表达构件的CMV-VP1-BGHpA片段;将扩增产物回收纯化后,与pGEM 中文摘要T工asy载体连接,转化DH。。大肠杆菌,筛选重组子,提取质粒进行酶切鉴定和测序;将扩增片段双酶切,与同样双酶切的质粒pCDNA3/hIL上连接,转化DH允大肠杆菌,提取质粒酶切鉴定,即构建成双表达重组质粒pCDNA3/VP foIL上。质粒大量扩增纯化后,肌肉注射免疫BALB七 小鼠三次。每次免疫后第六天,断尾取血检测CVB3中和抗体、第二次免疫后第七大用致死量CVB3感染小鼠,观察 pCDNA3/VP foIL刁对小鼠的免疫保护作用。 结果:门)构建的 pCDNA3/VP foIL《重组质粒中的插入片段 CMV-VP IBGHpA的长度符合 1.9 kb的预期值,经酶切鉴定和测序证实该插入片段正确无误;门)pCDNA3/VPI人IL上重组质粒免疫小鼠后,能诱导机体产生中和抗体,各次免疫后的平均抗体效价分别为叫:5,1:ZS.281:45.95;pCDNA3/VPI+ pCDNA3/hIL-2共注射组各次免疫后的平均抗体效价分别为叫j,卜26.Zg,1:42.8卜 而pCDNA3/VPI iii只在第。次免疫后出现低水平抗体,效价人 l:22.97。。3)Jll 800TCID50CVB3 感染小鼠,pCDNA3/VP foIL二 双农达质粒组,pCDNA3/VPI+pCDNA3thIL上共注射组,pCDNA3/VP组,pCDNA30上组,pCDNA3组及生理盐水对照组生存率分别为 25%,10%,15%,5%,15%,10%;经/检验,六组小鼠生存率无明显差异(P>0.05人 结论:门)本研究成功的构建了双表达真核重组质粒pCDNA3/VP foIL-2。(2)pCDNA3/VP foIL-2 t乡质粒在小鼠体内能够表达并能诱导机体产牛较单独的pCDNA3/VH 免疫绢出砚更宁、水平更高的中和抗休,且 中文摘要抗体效价随免疫次数增加而提高。门)在本研究所应用的免疫程序下,pCDNA3/VP lhlL上双表达质粒 DNA疫苗对致死量CVB3感染无明显保护作用。