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多肽、蛋白质等生物大分子药物由于易被胃酸破坏、酶降解和肠肝循环的代谢分解,目前临床只能采用注射给药途径。由于生物技术的飞速发展,每年有大量的生物制剂应用于临床,迫切需要研究生物大分子药物的非注射给药制剂。本文以胰岛素为模型药物,分别探讨了粘膜和肠溶给药两种给药系统,为生物大分子药物非注射给药提供了一种可能的方法。
一、生物大分子粘膜给药系统生物粘附给药系统是一类能够透过粘膜吸收,克服肠肝循环的新型给药系统,特别适用于像胰岛素这类不能通过口服的生物大分子药物,为其提供了一种全新的非肠道、非注射给药途径。粘膜给药由于给药方便,本应成为口服给药以外最优选的给药方式,但目前粘膜给药所占的比例远低于注射给药,其原因是生物大分子粘膜给药跨膜转运速率极低(分子量大于4000),生物利用度不足1％。研究生物大分子粘膜给药的跨膜转运行为不仅具有较高的学术价值,而且实用价值十分明显。
粘膜和外界直接接触,本身具有很强的自我防御功能,对于外来异物能够很快的廓清。本研究从影响粘膜跨膜转运三个关键因素入手,利用相亲相容的原理,在制剂的载体材料引入粘膜表面纤毛大量存在的巯基,提高其生物粘附性；利用微囊保护的方法,将目标药物进行微囊化加工,避免粘膜表面酶对药物的降解；利用形态识别的特性,制成易于胞噬、胞饮的载药纳米粒,提高跨膜转运速率。
1.巯基化壳聚糖载体材料制备以壳聚糖为原料,N-乙酰-L-半胱氨酸为巯基小分子,通过酰胺缩合反应,合成了壳聚糖-N-乙酰-L-半胱氨酸偶合物(CS-NAC)。结果表明,CS-NAC具有较高巯基含量,最高可达589.3μmol/g,引入巯基含量的高低主要取决于缩合剂EDAC、HOBt和NAC的摩尔比,同时pH和反应时间也会影响巯基的引入。相比于壳聚糖,CS-NAC具有更好的溶解性,在pH<12范围内都能溶解；而且具有快速的溶胀性能,是壳聚糖的2倍以上；且粘附性显著增强,粘附时间和粘附力分别是壳聚糖的30和3倍。细胞毒性试验证明,CS-NAC对细胞并无明显的毒性作用,因此可认为该材料为低毒性的生物粘附性材料。
2.巯基化壳聚糖载药纳米粒的制备用离子凝胶化的方法制备CS-NAC纳米粒的粒径在200 nm以下,其表面都带正电荷(+19.5～+31.7 mV),能有效的包裹胰岛素(载药量最高可达37％)。由于巯基的引入,CS-NAC纳米粒对粘蛋白的吸附显著增强,是壳聚糖纳米粒的1.8倍。
3.体内外释放行为研究负载胰岛素的CS-NAC纳米粒在pH 6.8的磷酸缓冲液具有快速的释放行为,这取决于巯基含量。因为巯基含量决定了纳米悬浮液的pH值和纳米粒的溶胀性及亲水性,而这些都能改变胰岛素的释放速率。CS-NAC纳米粒包裹胰岛素后能有效保持胰岛素的活性结构,排除了与胰岛素发生二硫键交换的可能。在生理条件下,CS-NAC能够改善胰岛素的鼻腔吸收,其纳米制剂对胰岛素促进吸收效果比负载胰岛素的壳聚糖纳米粒和胰岛素控制液好。鼻腔胰岛素的促吸收认为主要基于二硫键“锚”的作用机制--高粘附性和渗透性。
二、生物大分子肠溶给药系统研究生物大分子药物的口服给药能否实现关键在于,保护其不受胃液(pH 1.4)中酸性物质的破坏,安全进入肠道后在pH 7.4下溶出并释放出来,将其制成肠溶药物制剂。本研究通过离子相互作用制备出巯基化的壳聚糖/聚天冬氨酸纳米粒,利用巯基自氧化形成的二硫键交联结构的酸稳定性和聚天冬氨酸的碱溶胀性,减少了生物大分子药物在胃中的损耗,使药物得以在肠道中释放。所以该研究不仅对胰岛素口服给药具有重要意义,而且对其它类对胃有刺激性的药物(如阿斯匹林等)的肠溶制剂研究也具有十分重要的意义。
1.巯基化聚天冬氨酸载体材料制备通过酰胺缩合反应得到的聚天动氨酸-巯基乙胺偶合物(PASP-CA和PASP-g-PEG-CA)具有高的巯基含量,分别为1057.2μmol/g和815.2μmol/g。PASP-CA和PASP-g-PEG-CA吸水后迅速溶胀,而且碱性条件要好于酸性条件。粘附实验结果显示,PASP-CA和PASP-g-PEG-CA未比PASP表现出明显强的粘附性,但PASP-g-PEG-CA仍表现出一定的粘附性,这可能与巯基的稳定性以及材料以钠盐形式存在有关。另外,巯基化聚天冬氨酸对细胞并无明显毒性。
2.巯基化聚天冬氨酸/壳聚糖载药纳米粒的制备二硫键交联聚天冬氨酸/壳聚糖纳米粒是以氯胺T为氧化剂,对聚天冬氨酸/壳聚糖纳米复合物上的巯基进行氧化而成。纳米粒的粒径在120～170 nm,交联前后无明显变化,其表面都带负电荷(-22.5～-14.1 mV)。交联后的纳米粒在酸性条件下更加稳定,透射电镜显示其在pH 1.2时形成紧凑的核壳结构,而在pH 6.8时粒径明显增大,具有明显的pH响应性。该材料能有效的包裹胰岛素,载药量可高达50％左右,而且胰岛素并未因氧化剂而失活。纳米粒对粘蛋白的吸附取决于粒子的组成、交联以及pH等。其中,粒子组成中CS-NAC的含量影响最为明显。纳米粒的溶胀性具有很好的pH响应性,酸性下(pH 1.2)粒子溶胀不明显,中碱性(pH 6.8)下迅速溶胀。 3.胰岛素的控制释放研究二硫键交联聚天冬氨酸/壳聚糖纳米粒的胰岛素释放具有明显的pH响应性。在酸性条件下(pH 1.2),胰岛素慢释放；在中碱性条件下(pH 6.8),胰岛素快释放。这种释放的行为受纳米粒的交联度和组成影响。这种二硫键交联的pH响应纳米粒对于胰岛素的口服给药是极其有利的,它能降低胰岛素在胃中的损耗,增加了胰岛素在肠道的有效释放,而且纳米粒能够很好的保持负载的胰岛素活性,保证了胰岛素的降糖功效,有望应用于胰岛素的口服肠溶制剂。