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骨髓间充质干细胞(MSCs)具有定向分化和自我更新的潜能,现已成为骨疾病治疗中的热点。骨形态发生蛋白9(bone morphogeneticprotein9,BMP9)对MSCs的成骨作用强于家族其他成员,且对其知之甚少。Notch信号调控着细胞的增长分化,并且协同BMP9诱导MSCs的早期成骨作用。本研究旨在明确BMP9对间充质干细胞成骨分化过程中的影响(第一部分),系统研究Notch信号在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中的作用(第二部分)以及其调节机制的初步探讨(第三部分)。第一部分骨形态发生蛋白9对间充质干细胞成骨分化的影响目的:研究验证BMP9对MSCs成骨分化过程的影响。方法:利用腺病毒过表达载体(AdBMP9/AdGFP)分别处理C2C12细胞,用活性定量和细胞化学染色测定早期成骨指标碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP),利用茜素红S染色、免疫组化和RT-PCR检测方法测定晚期成骨指标骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)和钙盐沉积。通过WB方法检测BMP9经典信号通路BMPs-Smad和非经典信号通路BMPs-MAPK中主要胞浆蛋白的表达。结果:AdBMP9处理细胞后,3、5、7天ALP活性以及7、14天钙盐沉积持续增加(P<0.05),并与AdBMP9呈剂量依赖性;同样,7、9、11天OPN和OCN表达量持续上调(P<0.05)。同时发现,BMPs经典和非经典通路中Smad1/5/8、P38、Erk1/2、JNK的磷酸化蛋白表达水平均有上调(P<0.05),而总蛋白量则没有明显变化。结论:BMP9可以同时激活BMPs经典和非经典信号通路,参与间充质干细胞C2C12的成骨过程。第二部分Notch信号在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中的作用目的:研究明确Notch信号在BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化过程中的作用。方法:通过细胞密度激活实验和使用Notch信号抑制剂DAPT阻断Notch信号探讨Notch信号在BMP9诱导MSCs成骨分化过程中的作用;用细胞化学染色和活性测定早期成骨标志物ALP的表达;通过RT-PCR检测晚期成骨标志物OCN的表达情况。结果:AdBMP9处理C2C12细胞后,40%和80%细胞密度组ALP和Hey1表达量均高于20%组(P<0.05);而后期检OCN和Hey1表达量与20%组相比,无明显变化;早期检测DAPT抑制组中ALP活性以及Hey1表达量明显降低(P<0.05),晚期检测DAPT组7、9、11天OCN的表达量与BMP9组相比均有所下调(P<0.05),而9、11天Hey1表达则无明显变化。结论:Notch信号能促进BMP9诱导的MSCs的成骨分化。第三部分Notch信号调节骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化机制的初步探讨目的:初步探讨Notch信号参与BMP9诱导MSCs成骨分化过程的作用机制。方法:使用DAPT5d后,通过检测胞膜上BMPs信号受体、胞浆中蛋白以及转录子,从胞膜、胞浆、胞核三方面研究其作用机制。结果:AdBMP9处理C2C12细胞后,DAPT抑制组中ALK2受体下调,而其他受体无明显变化;经典通路中Smad1/5/8以及非经典通路中Erk1/2、P38的磷酸化水平都有所降低(P<0.05)。转录子Runx2、Colla-1以及BMPs靶基因Id1、Id2、Id3表达均有降低(P<0.05)。结论:Notch信号通过影响BMPs信号经典和非经典信号通路,从而启动与成骨相关转录子(如Runx2、Colla-1等)来控制MSCs的成骨分化过程的。