RNA编辑是普遍存在于高等植物细胞器中的一种转录后加工的生物学过程,即通过改变RNA来改变其遗传信息,在高等植物中,RNA编辑主要是存在于线粒体和叶绿体 的胞嘧啶(C)到尿嘧啶(U)的转化,这一生物学过程与PPR蛋白密切相关。PPR蛋白是近年来新发现的一类蛋白家族,是由2-27个以35个氨基酸为一个重复单元的PPR基序构成,陆生植物以拟南芥和水稻居多,分别有450和477个成员。除PPR蛋白之外还有另外一种蛋白(MORFs)被发现能和PPR一起参与RNA编辑。水稻中已报道的PPR蛋白屈指可数,本文旨在寻找水稻中新的PPR蛋白并研究其在细胞器RNA转录后加工过程中所起的作用。通过反向遗传学及RNAi、反义链干涉及CRISPR/Cas9技术,获得了两个表型差异明显的PPR突变体水稻:ppsl和Ospgll。研究发现,PPS1是一个定位于线粒体的PPR蛋白,而OsPGL1是一个线粒体和叶绿体双定位的蛋白,PPS1能够影响线粒体基因nad3转录本中5个位点的编辑,OsPGL1则既影响线粒体基因ccmFc转录本的编辑也影响叶绿体基因ndhD转录本的编辑,且都为单个位点的编辑。这两个PPR蛋白的功能缺失导致特异位点的RNA编辑效率降低最终造成水稻植株表现出包括营养生长和生殖生长在内的缺陷型表型。针对这两个新的PPR蛋白具体研究结果概括如下:(1)通过RNAi及反义链干涉技术,我们分别获得ppsl和Ospgll两个基因的转基因干涉株系若干,对其T0代进行表型鉴定发现ppsl有两个系表现出矮化、花药短小、花粉出现部分不育,结实率低等性状。对Ospgll基因反义链干涉植株的T1代进行表型鉴定发现有一个株系表现出叶色变浅的表型。随着CRISPR/Cas9技术的出现,我们又对这两个基因做了 CRISPR基因敲除并获得了跟干涉株系相同表型的突变体,并对其展开详细研究。(2)因本文所研究的两个PPR都为PLS亚家族里面的DYW型PPR蛋白,序列分析发现DYW结构域类似于胞嘧啶脱氨酶活性域结构,该类蛋白被认为是一类线粒体或叶绿体RNA编辑因子,因此我们对两个突变体的线粒体和叶绿体所有的编辑位点的编辑效率进行分析,发现在ppsl中线粒体基因nad3转录本在5个位点处出现了编辑效率严重降低的现象,而在Ospgll中我们发现在线粒体基因ccmFc及叶绿体基因ndhD转录本中各有一处编辑位点编辑效率降为零。从而证明这两个PPR蛋白均参与细胞器RNA编辑。(3)通过RNA EMSA实验发现,两个PPR蛋白在体外均能和其编辑位点所在的顺式作用元件直接结合,证明两个PPR蛋白都具有特异性RNA结合活性,除此之外我们发现编辑位点与距离最近的结合位点之间的间隔为4-5个核苷酸。进而推测这一间隔区可能对脱氨酶分子的嵌入起着不可或缺的作用。(4)通过BN-PAGE实验及复合体活性染色实验,我们发现在ppsl中,线粒体电子传递链的五个复合体中有三个(复合体Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ)活性明显低于野生型,复合体活性的降低导致线粒体形态结构出现严重紊乱最终造成花粉发育出现部分不育。而在Ospgll中,叶绿体形态结构出现异常,但线粒体跟野生型相比几乎没有变化,我们推测可能因为在OsPGL1所参与的两个编辑位点中,叶绿体基因ndhD-878位点编辑事件的“滞留”引起其所编码的第293个氨基酸不能由丝氨酸(Ser)变成亮氨酸(Leu)而造成叶绿体发育异常,而在线粒体基因cmFc-543位点上由于密码子简并性,其编辑事件滞留并未使其编码的氨基酸发生变化,从而不会影响线粒体的形态结构。(5)PPR蛋白参与RNA编辑有时也离不开MORF蛋白的辅助,水稻中有7个定位于细胞器中的MORF蛋白,其中包括一个MORF1-like(Os11g11020)、两个 MORF2-like(Os06g02600,Os04g51280)、一个 MORF3-like(Os03g38490)、两个 MORF8-like(Os09g04670,Os09g33480)以及一个 MORF9-like(Os08g04450)。其中MORF1和MORF3定位于线粒体,MORF2和MORF9定位于叶绿体,MORF8是线粒体和叶绿体双定位蛋白,基于PPS1只参与线粒体基因转录本的编辑的特点,我们通过酵母双杂交技术发现PPS1不与任何OsMORF蛋白互作,而 OsPGL1 能和三个 OsMORF(OsMORF2、OsMORF8 和 OsMORF9)蛋白相互作用,这一互作关系通过体外体内一系列实验得到证实。这些结果也证实了前人的研究结论,即PPR蛋白作为细胞器RNA结合因子,跟MORF蛋白及其他未知蛋白形成复杂的编辑复合体共同对其靶标RNA位点进行编辑。综上所述,本研究揭示了两个含有DYW结构域的PPR蛋白,PPS1和OsPGL1,他们有着共同的对细胞器RNA进行编辑的功能,这些位点的编辑引起的蛋白质的改变对线粒体复合体的组装、叶绿体的发育起着非常关键的作用,进而对水稻的营养生长和生殖生长起着至关重要的调控作用,为水稻雄性不育资源的挖掘和利用提供了新的视角。