目的：观察β-Catenin信号转导通路在骨重塑过程中的作用;探讨健腰密骨片以及补肾类中药有效组分(蛇床子素、补骨脂素和淫羊藿苷)介导β-Catenin信号转导通路调节骨重塑的机制;进一步阐述中医“肾主骨”理论的科学内涵。　　 方法：　　 一、β-Catenin信号转导通路调节骨重塑的研究　　 1.通过杂交繁殖,获得雌性6月龄和12月龄Axin2-/-基因敲除小鼠(Knock out mice,KO mice)和同窝出生的野生型小鼠(Wild type mice,WT mice),取股骨标本进行Micro-CT扫描分析,采用三点弯曲实验检测股骨干的力学性能变化,并利用组织形态计量学方法分析近端胫骨干骺端骨组织结构。　　 2.从6月龄WT、Axin2-/-、β-Cateninloxp/loxpp和Axin2-/-;β-Cateninloxp/loxp小鼠中分离培养骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell,BMSc),分别检测成骨细胞以及破骨细胞增殖和分化能力。　　 3.从出生3天的野生型小鼠、TopgM转基因小鼠和Bmp2loxp/loxp;Bmp4loxp/loxp条件性基因敲除小鼠中分别分离培养原代颅盖骨成骨细胞,经GSK-3β抑制剂BIO干预后,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)反应检测成骨细胞标志基因表达的情况,采用Western Blot法和细胞免疫荧光标记染色检测β-Catenin蛋白表达的情况。　　 二、健腰密骨片及其有效组分介导β-Catenin信号转导通路调节骨重塑的研究　　 1.建立转染12×SBE-OC-Luc报导基因的成骨细胞株OCT-1细胞(以下简称12×SBE-OC-Luc-OCT1细胞),分别采用健腰密骨片及其有效组分进行干预,利用荧光技术检测成骨细胞12×SBE-OC-Luc的活性。从出生3天的野生型小鼠、BMP2loxp/loxp条件性基因敲除小鼠和β-Cateninloxp/loxp条件性基因敲除小鼠及Topgal转基因小鼠中分离培养原代颅盖骨成骨细胞,经补肾类中药有效组分(蛇床子素、补骨脂素和淫羊藿苷)干预后,检测其对成骨细胞分化的影响。　　 2.从出生3天的野生型小鼠、β-Cateninloxpp/loxp纯合子小鼠及OPG-/-纯合子小鼠和同窝出生的OPG+/+野生型小鼠中分离培养原代颅盖骨成骨细胞,进行健腰密骨片中补肾类中药有效组分的干预,利用实时荧光定量PCR反应和Western Blot法检测成骨细胞中OPG mRNA和RANKL mRNA的表达以及β-Catenin蛋白的表达。从6月龄的OPG-/-纯合子小鼠和同窝出生的OPG+/+野生型小鼠中分离培养BMSC细胞,经诱导培养和健腰密骨片有效组分干预后,利用TRAP染色观察破骨细胞形成情况。　　 3.选择雌性6月龄TopgM转基因小鼠、Axin2基因敲除(KO)小鼠和同窝出生的雌性野生型(WT)小鼠,随机分为模型组和假手术组,通过摘除双侧卵巢建立肾虚型动物模型,于造模1个月后处死小鼠,分别取肾脏、卵巢组织(假手术组)和骨髓间充质干细胞,进行β-gal染色,以检测β-Catenin信号的表达情况;并取胫骨近端组织进行Micro-CT扫描分析骨量。选择雌性6月龄SD大鼠,通过去卵巢建立肾虚型动物模型,经健腰密骨片及其补肾类中药有效组分治疗后,采用双能X线骨密度仪检测大鼠全身骨密度(BMD),采用Micro-CT扫描和骨组织形态计量学分析大鼠腰椎骨小梁形态结构,采用骨生物力学仪检测大鼠股骨强度。　　 结果：　　 一、β-Catenin信号转导通路在骨重塑过程中的作用。　　 1.Western Blot分析结果证实,Axin2 KO小鼠骨髓间充质干细胞(BSMc)中β-Catenin总蛋白和非磷酸化蛋白水平明显增加,表明Axin2基因敲除可激活β-Catenin信号转导通路。　　 2.Micro-CT分析结果表明,6月和12月龄Axin2 KO小鼠骨密度比同窝出生的野生型小鼠明显增加,并且骨小梁也明显致密。　　 3.骨组织形态计量学分析结果显示,Axin2 KO小鼠成骨能力明显加强,破骨细胞形成明显减少。骨生物力学检测结果表明,Axin2 KO小鼠骨强度显著增加。　　 4.体外实验发现,Axin2 KO小鼠BSMc细胞的增殖明显增加,向成骨细胞分化明显加速。Axin2 KO小鼠BSMc细胞中OPG表达明显增加,从而导致在Axin2 KO小鼠中破骨细胞形成显著减少。进一步研究发现,Axin2 KO小鼠BSMc细胞中碱性磷酸酶活性和成骨细胞相关标志基因的表达明显上升,而这种变化在β-Catenin基因缺失后即消失,表明β-Catenin是BSMc向成骨细胞分化的主要调节因子。Axin2 KO小鼠BSMc细胞中BMP2和BMP4 mRNA的表达水平以及磷酸化Smad1/5/8蛋白的表达水平明显增加。　　 5.特异性糖原合酶激酶(GSK-3β)的抑制剂BIO可显著激活β-Catenin信号转导通路。在体外实验中,BIO上调原代小鼠颅骨成骨细胞中BMP2和BMP4的表达,显著诱导正常小鼠成骨细胞中Osx、Coll、Alp和Oc的表达,但这种作用在BMP2/BMP4缺失的成骨细胞中被明显阻断。　　 二、健腰密骨片及其有效组分介导β-Catenin信号转导通路调节骨重塑。　　 1.转染12xSBE-OC-Luc报导基因后成骨细胞生物学性状未发生改变,其与骨支架材料亦具有良好的生物相容性,通过检测药物对该转基因细胞荧光素酶活性的影响,筛选出对BMP有刺激作用的药物,从而建立了治疗骨质疏松症药物的体外筛选平台。　　 2.利用上述方法建立的转染12xSBE-OC-Luc报导基因克隆细胞株,系统筛选出健腰密骨片及其有效组分蛇床子素、补骨脂素和淫羊藿苷等补肾类中药有效组分可显著促进BMP的活性,从而促进骨形成,其中蛇床子素的效果最显著。　　 3.蛇床子素、补骨脂素和淫羊藿苷等补肾中药有效组分可激活成骨细胞中Wnt/β-Catenin信号转导通路,进而促进BMP的表达,从而促进成骨细胞的分化和骨形成;并可通过激活β-Catenin-OPG信号转导通路而抑制破骨细胞的形成。　　 4.在去卵巢肾虚型骨质疏松动物模型的肾脏组织和骨髓间充质干细胞中β-Catenin信号转导通路的活性被明显抑制,通过激活β-Catenin信号转导通路可显著抑制肾虚引起的骨量减少。　　 5.健腰密骨片及其有效组分激活β-Catenin信号转导通路,能显著提高去卵巢肾虚型骨质疏松性大鼠的骨量,改善其骨小梁微细结构,并增强骨骼的生物力学性质,从而达到治疗骨质疏松症的作用。　　 结论：　　 一、激活β-Catenin信号转导通路可通过作用于其下游BMPs促进成骨细胞增殖和分化;还可通过作用于OPG抑制破骨细胞形成,从而发挥调节骨重塑的作用。为防治骨质疏松症的药物研发找到了潜在的分子靶标。　　 二、健腰密骨片及其有效组分蛇床子素、补骨脂素和淫羊藿苷等通过激活β-Catenin信号转导通路而调节骨重塑,不仅促进骨形成,而且抑制骨吸收,从而防治骨质疏松症。揭示补肾类中药防治骨质疏松症的作用机制,从分子水平进一步阐述中医“肾主骨”理论的内在规律与科学内涵。