我国是一个养猪大国,同时也具有丰富的地方特色猪品种。但是许多优秀地方特色猪种并没有充分得到利用,其开发利用和发掘的潜力是非常巨大的,广西巴马小型猪作为我国特有的一种小型猪品系,其遗传及表型特征稳定,同时在生理和解剖学等方面与人类相似,已被用于外科训练、药物评价及人类异种皮肤移植试验。开展广西巴马小型猪转基因克隆研究仅有效保存地方猪的优秀遗传特性,而且还为人类生物和医学领域提供理想的动物模型,有助于提升地方猪的应用范围和价值。因此以广西巴马小型猪为研究对象是一种理想生物和医学模型。本研究采用胰蛋白酶法制备新生广西巴马小型猪肾脏成纤维细胞,建立巴马小型猪肾脏成纤维细胞体系。以PEGFP-N1质粒用于电转染成纤维细胞并优化电转染参数,在优化的电转染参数下转染成纤维细胞并成功筛选出阳性成纤维细胞。以筛选出的转基因成纤维细胞为供体细胞,成功构建了转基因克隆胚胎。通过胚胎移植来进一步在体内验证转基因克隆胚胎的生育能力,并尝试为构建存活的转基因克隆猪提供了支持。为构建转基因克隆胚胎,我们开展了如下试验：实验一、以巴马小型猪新生猪仔为材料,采用胰蛋白酶消化法来建立巴巴小型猪肾脏成纤维细胞体系。并成功获得了猪肾脏成纤维细胞用于核移植的供体细胞。实验二、探索电压对巴马小型猪肾脏成纤维细胞的存活率的影响。分别以0、80、100、120、140、160的电压对成纤维细胞进行电击,发现细胞随着电压的增加,细胞存活率下降,在120V的电压下细胞的存活率为大约为50%。实验三、摸索巴马小型猪肾脏成纤维细胞电穿孔转染条件。采用电转仪对小型猪肾脏成纤维细胞进行电转pEGFP-N1质粒,分别以0、80、100、120、140、160的电压对成纤维细胞进行电击,发现细胞随着电压增加,细胞转染率上升,以电击后的细胞存活率、发荧光比例为综合考虑来判定电转染参数优劣。在电压对细胞的存活率的影响和电压对细胞转染效率的双重影响下,发现选择在电压120V,脉冲时程20ms,脉冲次数为2次(间隔1min)时为最佳的电转染参数。实验四、利用电转染的肾脏成纤维为供体细胞构建转基因克隆胚胎并移植,研究转基因克隆胚胎和非转基因克隆胚胎在发育能力的比较,发现了转基因克隆胚胎和非转基因克隆胚胎在胚胎分裂率和囊胚率(8.1%vs6.7%)是都是没有显著差异的(p>0.05)。总之,我们利用电转染方法构建巴马小型猪肾脏转基因成纤维细胞体系,并利用转染的成纤维细胞构建转基因克隆胚胎。