论文部分内容阅读
背景和目的:肝脏中脂肪酸的过度沉积会通过脂毒性导致非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的发生发展,但其中涉及的分子机制尚不明确。胱硫醚-β-合酶(cystathionine-β-synthase,CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)是体内内源性硫化氢(hydrogensulfide,H2S)的主要产生酶,已被发现受到脂肪酸的调控并参与NAFLD发病机制。本研究旨在探究另一内源性H2S产生酶,3-巯基丙酮酸转移硫酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,MPST)在 NAFLD 发生发展中的作用及机制。材料和方法:采用游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)(油酸:棕榈酸为2:1)混合培养液刺激人正常肝细胞L02细胞,及高脂饮食(high fat diet,HFD)喂养C57BL/6小鼠分别建立NAFLD细胞及动物模型,用Western Blot法检测MPST在NAFLD模型中的表达水平。采用免疫组化法检测MPST在NAFLD临床患者肝脏标本中的蛋白表达水平。采用重组腺病毒介导shRNA结合尾静脉高压注射技术对小鼠体内肝脏MPST的表达进行干预,并在借助转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技术构建的 C57BL/6 为背景的 MPST 基因敲除杂合子小鼠中进一步观察MPST对肝脏脂肪变性的影响作用。在FFA刺激的L02细胞中,分别运用siRNA和转染MPST过表达质粒以干预MPST表达,观察MPST对肝细胞脂肪变性的影响与作用。采用H&E及油红O染色观察肝脏和肝细胞脂变程度,通过测定肝甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量及FFA水平,联系H2S水平变化,MDA及SOD活性等指标变化研究MPST对肝脏脂肪变性及氧化应激的影响。通过外源性H2S供体的应用,检测CSE及SREBP-1通路、JNK磷酸化水平变化,免疫共沉淀(Co-Imnunoprecipitation,CoIP)技术探究潜在的分子机制。结果:FFA的刺激诱导MPST在人脂变肝细胞中表达上调,并部分依赖于NF-1κB/p65。在HFD诱导的小鼠NAFLD模型及临床NAFLD患者肝脏中,MPST蛋白表达水平显著升高。应用MPST-shRNA重组腺病毒尾静脉高压注射介导小鼠肝脏MPST表达部分敲低,和使用MPST基因敲除杂合子小鼠介导遗传性的MPST表达部分缺失,均能显著改善HFD诱导的肝脏脂肪变性程度。和体内水平一致地,在L02细胞中抑制MPST表达后,FFA诱导的肝细胞脂变显著改善,而过表达MPST后则脂变加剧。有趣的是,部分敲低MPST会显著上调H2S水平,相反地,过表达MPST则显著下调H2S水平。CoIP实验揭示MPST可以通过直接蛋白-蛋白相互作用而负调控CSE——肝脏中H2S产生主要酶。且进一步的机制研究发现,H2S在MPST对脂肪肝的调节过程中起重要介导作用,与脂肪合成关键蛋白SREBP-1相关通路抑制,JNK磷酸化减弱及肝脏氧化应激改善有关。结论:FFA介导MPST表达显著上调,MPST通过CSE依赖途径调节H2S水平,在NAFLD发生发展中起到重要作用。这为基于MPST为潜在靶点的NAFLD新药研发提供了新的理论依据,部分抑制MPST有望成为治疗NAFLD新策略。