背景:Graves病(Graves’disease,GD)的发病率约为1%,是一种比较常见的内分泌疾病。他与桥本甲状腺炎、产后甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎共同被称为自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease,AITD)。GD的主要特征有弥漫性甲状腺肿大、高甲状腺素血症、甲状腺自身抗体阳性、眼征、皮肤改变等。像其他自身免疫性疾病一样,GD的病因被认为有三方面,分别为遗传因素、环境因素以及自身免疫性因素,在遗传因素的基础上,由环境因素诱发的自身免疫反应可能是其致病及发病的基本过程。其免疫学病因已经基本清楚,是产生了针对促甲状腺素受体的甲状腺刺激性抗体,但遗传学上的确切的致病原因,也就是易感基因尚未完全清楚。研究表明,GD的发病有家族聚集倾向,患者同胞的患病风险是普通人的10余倍;同卵双胞胎的患病一致率明显升高,达到20%,这远高于异卵双胞胎;有研究表明甲状腺自身抗体可在50%的患自身免疫性甲状腺疾病的父母和同胞中出现。这诸多证据支持遗传因素在GD的发生及发展过程中起到了至关重要的作用。GD易感基因的研究存在诸多困难。首先,GD是一种复杂的多基因病,并不遵循经典的孟德尔定律,他可能存在多种致病基因,而且外显率各不相同。其次,其发生发展过程还受环境因素的影响。目前应用在多基因疾病易感基因研究的策略,主要有候选基因以及定位克隆的策略,但研究方法并非孤立,而是多方面的穿插甚至结合,这仍然延续了单基因遗传病的研究方法。(1)候选基因的方法:是根据疾病的发生发展规律及发病机制和基因的生理学作用,来寻找候选基因,用研究证实其在疾病发生发展过程中发挥作用,还可以在家系和(或)散发人群中,研究该基因内或邻近基因的多态,在患病人群和正常人群间的频率是否存在显著差异,来证实该基因为疾病的易感基因。获取候选基因主要有三个途径:代谢通路中的基因、家系为基础的连锁分析获得的易感区域中的基因、差异表达获取的基因。GD是一种甲状腺器官特异性的自身免疫性疾病,其候选基因主要为免疫调节相关的基因和甲状腺特异的基因。(2)定位克隆的方法:定位克隆方法是通过全基因组扫描的方式寻找与疾病相连锁的区域,这并不需要知道所研究疾病的生物学或基因功能方面的知识。应用定位克隆的技术,文献已报道的与GD连锁的染色体区域有:5q31-q33、6p21、8q24、14q31、18q21、20q11、Xq等。本课题组在GD易感基因研究方面有一定基础。2003年,金迎博士等人利用54个汉族GD多发家系利用全基因组扫描的方法将GD的一个关键的易感基因定位于人染色体5q31区(微卫星D5S436-D5S434)。2005年,于扬博士等人利用54个汉族GD多发家系、146名散发GD患者与142名正常对照个体对染色体5q31区可能与GD发病相关的IL4、IL5、IL13、IL12B、IRF1、UGRP1等14个候选基因所有编码区和至少1,000bp的启动子区中的SNPs与GD的相关性进行了研究,结果未发现这些基因中的SNPs与GD的发病具有相关性,但IRF1基因6447T/G位点基因型为TT的GD患者的发病年龄要显著早于基因型为TG和GG的GD患者。单核苷酸多态性(SNP,single nucleotide polymorphism)主要是指在基因组中由点突变的单个核苷酸的所形成的基因多态性。它是最常见的一种可遗传的变异,占所有已知多态性的80%以上,在遗传学分析中,SNP是重要的遗传标记。SNP在人类基因组的平均密度估计约为1/1000bp,即每1000碱基即可出现一个SNP。SNP遍布于整个人类基因组中,可位于基因和基因之间(基因的非编码区以及基因间区)。某些位于编码区的SNP位点等位基因的不同,由于其突变可引起编码氨基酸的变化,导致蛋白质结构的变化;而蛋白表达水平的改变多由位于启动子区的SNP位点的点突变所引起;然而,往往某种疾病的发生发展可能与特定蛋白结构以及表达水平的改变所引起。所以,疾病的易感基因多在编码区和启动子区寻找,尤其是多基因疾病。而且与微卫星等重复序列多态性标记相比,SNP的遗传稳定性更高。与此同时,由于SNP的二态性,有利于对其进行基因分型,这就使其检测方法更易实现自动化。因此,目前SNP作为第三代遗传标记,已经广为用于疾病易感基因的研究。本课题组的于扬博士等人还通过74个SNPs的检测发现在人染色体5q31区(微卫星D5S436-D5S434)呈现典型的单体型域结构,由8个单体型域结构构成,而且每个单体型域结构是由数个具有代表性的tagSNPs来确定的。目的:本研究旨在以GD多发家系人群为研究对象,首先了解GD患者一二级亲属中甲状腺功能异常以及甲状腺自身抗体阳性的发生率,以确定在该人群中的甲状腺自身免疫遗传情况;其次,研究碘摄入量对甲状腺自身抗体的产生以及GD的患病的影响,以揭示碘作为环境因素是否增加具有遗传倾向的人群发生AITD的风险。本研究应用扩大的80个中国汉族GD多发家系,验证中国汉族Graves病的一个主要的易感位点位于人染色体5q31区,并通过加密的微卫星标记对GD易感基因进一步精细定位。基于本课题组已有的研究基础,于扬博士等人对人染色体5q31区构建单体型域结构,应用各个单体型域结构中的tag SNPs对中国汉族GD的易感基因进行深入研究。对象与方法:我们收集了80个GD多发家系,共计469名成员,197名GD患者,平均每个家系5.8人。均收自辽宁省的10个市县,均为汉族。在这些家系中,患病一级亲属数量分别有2名至5名,对应家系数量分别为42个(54%)、20个(25%)、6个(8%)和2个(3%)。为了研究GD多发家系成员的疾病发展规律,对家系进行了8年随访研究。我们从D5S436和D5S434这两个微卫星标记之间,挑选了8个杂合度超过70%的微卫星标记,对前期全基因组扫描确定的可能与GD连锁的区域进行精细定位。我们从D5S436和D5S434这两个微卫星标记之间已构建的单体型中挑选了两个与GD可能相关的单体型,应用Taqman方法检测了其中的tag SNPs。在此基础上,我们进行了传递不平衡检验、关联研究以及不同基因型和单体型患者临床参数的比较。结果:1、GD患者一二级亲属的亚甲亢、临床甲减、亚甲减患病率分别为4.8%、0.7%、2.2%;在甲状腺功能正常的GD患者的一级亲属中,TPOAb、TgAb、TRAb的患病率分别为19.3%、16.5%、17.7%。2、在GD多发家系中,GD患病率在尿碘水平达500~599?g/L时明显增加。3、初访时GD家系中甲功正常者(无病史),随访时亚甲亢、亚甲减、临床甲减(HT)的发病率分别为2.0%、6.9%、1.0%,抗体(TPOAb/TgAb)阳性的发病率为4.2%,TPOAb、TgAb的阳性发病率分别为4.2%、2.8%。4、在初访时甲功正常者(无病史)中,初访抗体阳性组随访时亚甲亢、亚甲减、临床甲减(HT)的发病率分别为6.7%、16.7%、3.3%,初访抗体阴性组随访时亚甲亢、亚甲减、临床甲减(HT)的发病率分别为0.0%、2.8%、0.0%。5、GD是一种复杂性疾病,遗传模式和外显率尚不清楚,具有明显的遗传异质性,我们对染色体5q31区的所选的8个微卫星标记(STRs)进行参数法连锁分析,计算不同遗传方式和外显率情况下的两点HLOD值。在隐性遗传、30%~100%外显率的模式下,得到了各位点的最大两点和多点HLOD值,D5S1480-D5S2014区域HLOD值均大于2,其中最高两点和多点HLOD值分别为4.29(α=0.42)和4.01(α=0.34),支持GD与5q31区显著连锁。6、非参数法连锁分析得到的最大NPL值为3.12,同样支持GD与5q31区连锁。7、所选的SNP1(rs7713010 C/T)、SNP2(rs12653715 G/C)、SNP3(rs12653081T/C)、SNP4(rs6882292 G/A)、SNP5(rs1368408 G/A)、SNP6(rs3910207C/T)、SNP7(rs3843496 C/T)、SNP8(rs3910183 T/G)、SNP9(rs2853697 A/C)各位点的等位基因和基因型在病例组和对照组中呈现相似的分布,频率差异并没达到统计学显著水平。8、位于JAKMIP2基因intron1内的SNP2(rs12653715 G/C)位点G等位基因与GD无显著关联(P=0.106),该位点的各基因型分布在病例组和对照组中也无显著性差异(P=0.117),但此位点GG纯合的个体患GD的风险显著高于GC杂合或CC纯合的个体(GG vs.GC+CC,OR=1.46,95%CI=1.011~2.108,P=0.043)。9、我们选取的JAKMIP2基因内的SNP1(rs7713010 C/T)、SNP2(rs12653715G/C)、SNP3(rs12653081 T/C)位点呈现连锁不平衡,传递不平衡检验结果显示,不仅SNP2位点G等位基因(P=0.0416)和SNP3位点C等位基因(P=0.0005)在杂合型父母向患病子女呈优势传递,而且,由SNP2 G+SNP3 C确定的单体型JAKMIP2-1,也存在明显的优势传递(P=0.0005)。10、我们选取的SCGB3A2基因内及附近的SNP4(rs6882292 G/A)、SNP5(rs1368408 G/A)、SNP6(rs3910207 C/T)、SNP7(rs3843496 C/T)、SNP8(rs3910183T/G)位点呈现连锁不平衡,各单体型以及各SNP位点的等位基因和基因型、在病例组和对照组中呈相似分布,其频率差异无统计学意义,也未呈现由杂合父母向患病子代的优势传递,P值均大于0.05。11、IL12B基因的SNP9(rs2853697 A/C)在GD患者与正常个体间的分布未见统计学差异;也未显示出杂合型父母向受累子代的优势传递。结论:1、GD患者的一二级亲属的疾病患病率(亚甲亢、临床甲减、亚甲减)与普通人群无显著差异;而在甲状腺功能正常的GD患者中,TPOAb、TgAb、TRAb的阳性率均显著高于普通人群。2、碘摄入量增加可能是具有明确遗传倾向的人群发生AITD的危险因素。3、GD患者的一二级亲属的疾病患病率(亚甲亢、亚甲减、临床甲减)和甲状腺自身抗体阳性率(TPOAb、TgAb)与普通人群无显著差异。4、甲状腺自身抗体阳性是GD家系成员罹患甲状腺疾病的危险因素。5、本研究验证了中国汉族Graves病的一个主要的易感位点位于染色体5q31区,这一区域是GD易感基因的重要候选区域。6、JAKMIP2基因可能是中国人Graves病的易感基因,JAKMIP2-1(SNP2 G+SNP3 C)可能是GD患病的高风险单体型。7、SCGB3A2基因与中国人汉族家族性Graves病无关联,可能不是其主要的易感基因。8、IL12B的SNP9(rs2853697 A/C)位点与中国人Graves病无关联。