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Aquaporin Z(AqpZ)是位于大肠杆菌细胞膜上的一类强疏水性跨膜蛋白,为水分子进出细胞提供专一性的跨膜通道,是重要固在蛋白家族通道蛋白的重要成员。由于其极高的水渗透性,稳定性及极低的活化能,AqpZ在发展仿生水过滤技术方向受到了众多的关注。获得足够量的AqpZ仍然是发展该项技术的一个重要瓶颈。
本文采用麦芽糖结合蛋白/多聚组氨酸构成的强亲水性二元亲和标签表达系统用于AqpZ的功能性重组表达。首先PCR手段在AqpZ基因下游引入8个组氨酸标签后连接到麦芽糖结合蛋白融合载体pMAL-p2及pMAL-c5e上成功构建表达载体pMAL-p2-AqpZ-HIS和pMAL-c5e-AqpZ-HIS。接着,考察不同表达宿主和表达优化条件对融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的上清表达水平的影响。结果表明超表达MBP-AqpZ-HIS没有诱发细胞毒性,并且在最佳表达条件下MBP-AqpZ-HIS上清表达表达量可以到达262 mg/L水平。对细胞膜的分离发现MBP-AqpZ-HIS几乎全部表达于细胞膜上。采用特异性酶切的方法将AqpZ-HIS从融合蛋白中释放出来,并以亲和层析为基础,根据融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的特点设计了两套分离纯化AqpZ-HIS的策略。经过最后一步亲和层析分离都可以得到高纯度的AqpZ-HIS。其SDS-PAGE的电泳行为和色氨酸荧光激发光谱表明了纯化后AqpZ-HIS以四聚体形式存在并具有强的热稳定性,暗示着其空间结构的正确折叠。
以上结果表明了,麦芽糖结合蛋白/多聚组氨酸构成的强亲水性二元亲和标签表达系统是一个十分有效的体系可用于MIP家族通道蛋白的在大肠杆菌中的嵌膜超表达及分离纯化。