论文部分内容阅读
目的:观察β-1,4-半乳糖基转移酶I、V(β1,4 galactosyltransferase I、V,β-1,4-GalT-I、V)在大鼠脊髓发育和损伤及疼痛模型中的表达情况,探讨其在脊髓的发育、损伤及痛觉传递与调制等过程中可能存在的生物学作用。方法:制备大鼠脊髓撞击和横断模型;实时荧光定量PCR检测β-1,4-半乳糖基转移酶I、V在脊髓发育的不同阶段及损伤脊髓中的mRNA表达变化;荧光原位杂交技术观察两个分子的细胞定位。Western blot、RCA-I凝集素免疫荧光染色(Lectin-fluorescent staining with RCA-I,RCA-I)技术、免疫荧光双标记及免疫沉淀等技术观察β-1,4-GalT-I和V以及Galβ1-4GlcNAc在脊髓发育及损伤后相应脊髓中的表达。同时,制备完全弗氏佐剂(Complete Freund’s adjuvant)炎性疼痛模型,检测辐射热刺激痛行为学改变,并观察β-1,4-半乳糖基转移酶I、V mRNA在相应背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)及脊髓中的表达变化。结果:(1)β-1,4-GalT-I在脊髓发育过程中有明显的表达变化。实时荧光定量PCR显示:β-1,4-GalT-I mRNA在胚胎发育中晚期脊髓(E18 d)明显升高。原位杂交和免疫荧光双标显示:β-1,4-GalT-I主要表达于神经元中。免疫沉淀显示:在胚胎中晚期神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)的Galβ1-4GlcNAc明显增加。(2)β-1,4-GalT-I在大鼠脊髓撞击后出现了表达变化。实时荧光定量PCR显示:β-1,4-GalT-I在损伤后8 h表达开始增高,在1 d达到高峰,之后逐渐下降。增高的mRNA主要分布于损伤局部细胞中。Western blot结果显示了类似的表达时相关系。免疫荧光双标显示:β-1,4-GalT-I主要表达于损伤周围的白质中的中性粒细胞、巨噬细胞和小胶质细胞,在少突胶质细胞和星型胶质细胞中几乎没有表达。用特异识别Galβ1-4GlcNAc的RCA-I(Ricinus Communis Agglutinin-I)凝集素免疫荧光方法研究脊髓损伤对β1,4-糖苷键合成的影响,发现Galβ1-4GlcNAc也主要分布在损伤周围的炎症细胞中。免疫沉淀和免疫荧光双标结果显示:脊髓损伤后E-selectin的Galβ1-4GlcNAc升高。(3)β-1,4-GalT-V在脊髓发育过程中也有明显的表达变化。实时荧光定量PCR显示:β-1,4-GalT-V mRNA在出生后3 d表达明显增高。原位杂交与间接免疫荧光双标显示:β-1,4-GalT-V主要表达在生后3 d的脊髓神经元中,在胶质细胞中有少量的表达。β-1,4-GalT-V在大鼠脊髓撞击和横断损伤后也出现了表达变化。实时荧光定量PCR显示:脊髓撞击后8 h和1 d是β-1,4-GalT-V mRNA的表达高峰。在脊髓横断损伤后,β-1,4-GalT-V在损伤上、下段表达高峰分别出现在损伤后8 h和1 d,之后逐渐下降,至伤后14 d降到低于假手术组水平。原位杂交结果显示:增高的mRNA均主要分布于损伤周围的细胞中及脊髓后角浅层的感觉神经元中。原位杂交与间接免疫荧光双标显示,β-1,4-GalT-V在脊髓白质发布于巨噬细胞、小胶质细胞中和少突胶质细胞。同时β-1,4-GalT-V mRNA在损伤后表达于富含P物质和IB-4的脊髓后角浅层的感觉神经元中。(4)在CFA单侧爪底注射后,引起了大鼠同侧热痛觉过敏,以4至6 h最明显,至少持续到72 h,而在对侧或NS组并未出现相同现象。在该炎性疼痛模型中,β-1,4-GalT-I, V mRNA在同侧相应DRG及脊髓腰膨大中均发生了动态改变,即:β-1,4-GalT-I mRNA水平在同侧DRG中1 h开始上调,并于1 d达到高峰;β-1,4-GalT-I mRNA在脊髓腰膨大中表达变化不明显。β-1,4-GalT-V mRNA在同侧DRG中在1 d出现表达高峰;在脊髓腰膨大中从1 h时开始升高,在4 h、1 d与2 d时表达显著增高。此外,形态学研究显示:β-1,4-GalT-I mRNA在DRG中的表达明显增多;β-1,4-GalT-V mRNA分布在与痛觉传递密切相关的细胞亚群,即在DRG中与许多IB4阳性的细胞有共定位,在脊髓中集中分布于后角接受伤害性和热感受性传入的区域板层(I、II层)。结论:(1)β-1,4-GalT-I在大鼠脊髓发育中的表达提示它在脊髓胚胎发育中晚期(E18 d)发挥重要作用。(2)β-1, 4-GalT-I在大鼠脊髓损伤后参与脊髓损伤后早期的炎症反应,这种作用可能是通过影响对E-selectin的Galβ1-4GlcNAc来实现的。(3)β-1,4-GalT-V在大鼠脊髓发育中的表达提示它对生后早期(P3d)脊髓神经元的发育发挥重要作用。在脊髓损伤后,β-1,4-GalT-V参与损伤后的继发性损伤,即损伤后早期的炎症反应,并可能与脊髓损伤后的神经病理性疼痛有关。(4)β-1,4-GalT-I, V可能参与炎性疼痛。