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研究背景皮肤恶性黑素瘤是皮肤恶性肿瘤的一种,发病隐匿和容易侵袭转移是其重要的临床特征。研究证明,上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)现象和恶性肿瘤的侵袭转移存在着非常密切的相关性,因此,从EMT这一角度进行研究是治疗皮肤恶性黑素瘤侵袭转移的新策略。肿瘤细胞EMT现象受细胞内在机制和肿瘤微环境组成的“龛(niche)”的影响。其中,肿瘤微环境中的纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)在EMT中发挥重要作用,然而其在皮肤恶性黑素瘤侵袭转移中的作用及机制缺乏系统深入的研究。为此,本课题探讨PAI-1对皮肤恶性黑素瘤侵袭转移的调控作用及其机制。研究目的1.检测PAI-1在皮肤黑素瘤中的表达。2.明确PAI-1对皮肤黑素瘤中侵袭转移的作用。3.阐明PAI-1调控皮肤黑素瘤中侵袭转移的机制。研究方法围绕上述研究目的,我们采用以下研究方法:一.PAI-1在皮肤黑素瘤中的表达1.通过免疫组化定位检测,我们观察PAI-1在皮肤恶性黑素瘤组织中的表达情况。2.通过免疫荧光技术验证人皮肤恶性黑素瘤组织中PAI-1的表达情况及检测PAI-1的来源细胞。二.PAI-1促进皮肤黑素瘤侵袭转移1.通过划痕、转移和侵袭三种实验,观察外源性PAI-1对皮肤恶性黑素瘤细胞株A375和SK-MEL-31侵袭转移能力的影响。2.通过划痕、转移和侵袭三种实验,观察过表达PAI-1对皮肤恶性黑素瘤细胞株A375侵袭转移能力的影响。3.通过构建的PAI-1过表达慢病毒后小鼠侵袭转移模型实验研究PAI-1对皮肤恶性黑素瘤A375细胞株侵袭转移能力的影响。三.PAI-1促进皮肤黑素瘤侵袭转移的机制1.通过免疫荧光、western blot观察外源性PAI-1对皮肤恶性黑素瘤细胞株A375刺激后NF-κB信号通路中的p65活化情况。2.通过抗体阻断等方法研究NF-κB信号通路在PAI-1调控皮肤恶性黑素瘤EMT及侵袭转移中的作用。研究结果1.PAI-1在皮肤恶性黑素瘤中的表达情况通过免疫组化定位检测,我们发现PAI-1阳性细胞主要集中分布于皮肤恶性黑素瘤的恶性肿瘤细胞表面和组织间质中。通过免疫荧光进一步检测人皮肤恶性黑素瘤组织中PAI-1的表达情况,结果与免疫组化相一致,人皮肤恶性黑素瘤恶性肿瘤细胞和组织间质中同样表达PAI-1。通过免疫荧光技术我们检测PAI-1的来源细胞,我们发现:PAI-1来源于CD68阳性细胞。2.PAI-1促进皮肤黑素瘤侵袭转移通过划痕、转移和侵袭实验,我们发现外源性PAI-1能够促进皮肤恶性黑素瘤细胞株A375和SK-MEL-31侵袭转移。通过划痕、转移和侵袭实验,我们发现过表达PAI-1能够促进皮肤恶性黑素瘤细胞株A375和SK-MEL-31侵袭转移。通过构建的PAI-1过表达慢病毒后小鼠侵袭转移模型实验,发现过表达PAI-1的皮肤恶性黑素瘤细胞株A375在裸鼠肺部细胞数量明显高于对照组。3.PAI-1促进皮肤黑素瘤侵袭转移的机制在皮肤黑素瘤细胞株中加入外源性PAI-1细胞因子刺激,24小时后,通过免疫荧光发现加入外源性PAI-1后,皮肤黑素瘤细胞的E-cadherin表达明显减弱,而Vimentin表达明显增强。通过免疫荧光和western blot发现皮肤恶性黑素瘤细胞株A375在PAI-1刺激5分钟和15分钟后,核内p65表达明显增加。应用p65特异性PDTC阻断剂阻断p65的入核作用,发现:体外应用p65阻断剂PDTC能够明显抑制PAI-1促进皮肤恶性黑素瘤A375细胞EMT现象和侵袭转移的能力研究结论在皮肤恶性黑素瘤中,来源于CD68阳性细胞的PAI-1能够与皮肤恶性黑色素细胞相结合,通过激活NF-κB信号通路,促进皮肤恶性黑色素细胞侵袭转移。