随着生活水平的提高、生活方式的改变和人口的老龄化,糖尿病患病率呈现出世界性的上升趋势,成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的第三位严重危害大众健康的慢性非传染性疾病。糖尿病及其并发症在许多国家已成为致死、致残的主要因为之一,有研究发现由糖尿病慢性血管并发症——动脉粥样硬化导致的死亡率占糖尿病患者总死亡率的80％左右。单核巨噬细胞参与到糖尿病血管并发症动脉粥样硬化的整个过程中,其中包括泡沫细胞和动脉粥样硬化斑块的形成,外周血中的单核细胞粘附于内皮细胞并迁移到内皮下间隙,摄取脂质转化为泡沫细胞是动脉粥样硬化形成的重要早期事件。同时,大量研究表明晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)在脉管系统的大量积聚在糖尿病血管并发症中发挥着重要作用。血液和组织中的蛋白质和脂质等生物大分子长期暴露在高糖基质环境中发生了非酶性变的麦拉德反应(Maillardreaction),最终导致AGEs的不可逆性形成。AGEs主要通过与血管细胞膜表面的AGEs受体——晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation endproducts.RAGE)结合后,激活细胞内多条信号转导通路,进而发挥其病理功能。　　 RAGE是细胞膜表面免疫球蛋白超家族跨膜受体的成员之一,能够与多种配体结合,其配体除AGEs和β样片层蛋白外,还包括S100蛋白家族的一些成员(如S100B、S100P、S100A4、S100A6、S100A8/9、S100A11-13)、高迁移率族蛋白1(high mobility group box protein1,HMGB1)和朊病毒蛋白分子。RAGE与配体的结合能够引起细胞内生物学功能的关键性改变,其中包括细胞增殖、迁移和炎性介质的产生,介导细胞内的应急损伤和应答反应,从而参与包括糖尿病慢性并发症、肿瘤、动脉粥样硬化、关节炎和神经退行性病变等一系列疾病的病理过程。尽管目前对于AGEs与RAGE结合引起多条信号通路的报道很多,但是直接关于RAGE受体下游近端信号事件的研究却很少。RAGE短小的胞内段在这些依赖RAGE的信号通路中起到了关键性的作用,但是目前对于胞内段所参与或激活的胞浆内信号通路的具体分子机制还没有报道。我们实验室在前期工作中运用T7噬菌体展示技术从人肺cDNA文库中筛选到与RAGE胞内段相互作用的12种蛋白,含有SH2结构域的76 kDa的白细胞蛋白(SH2domain-containing leukocyte protein of76kDa,SLP76)就是其中之一。　　 SLP76是血源性细胞所特有的一种接头蛋白,含有533个氨基酸,包括三个结构域:即含SAM结构域和三个酪氨酸磷酸化基序的酸性氨基末端、中间的富含脯氨酸结构域和羧基末端的SH2结构域。SLP76主要表达在造血系统和血小板、中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞及未成熟B细胞中,其在T细胞受体相关的信号通路及血小板凝血功能方面起到了重要作用。在细胞内SLP76可以和多种蛋白相互作用,包括能磷酸化SLP76的SYK家族激酶中的70 kDa的T细胞受体Zeta链相关蛋白激酶(the SYK-family kinaseζ-chain-associated protein kinase of70 kDa,ZAP70)、激活T细胞的跨膜接头蛋白(the adaptor proteins of linker for activation of T cells,LAT)、磷脂酶Cγ1(phospholipase Cγ1,PLCγ1)、鸟嘌呤核苷酸交换因子VAV和生长因子受体结合蛋白2(Grb2-related adaptor downstream of Shc,Grb2)等一些蛋白分子,它们共同组成接头蛋白复合体参与到多条信号通路中。　　 基于上述认识,我们提出以下假设:当AGEs和RAGE结合后,RAGE胞内段通过与由SLP76参与构成的接头蛋白复合体相互作用,再由复合体中的Grb2将信号传递给Ras,Ras可以激活下游的丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶Raf,信号由高度保守的三级激酶模式向下游传递,进而触动细胞内的氧化应激并导致核转录因子(nuclear factor-κ-gene binding,NF—κB)的活化,使得效应细胞细胞因子表达量发生变化,产生相应的病理学效应。如果上述假设能够得到证实,对阐明RAGE和SLP76相互作用在细胞信号转导过程中的作用具有重要意义,并且能够以RAGE和SLP76相互作用为切入点揭示糖尿病血管并发症动脉粥样硬化的发病机制,为其寻找临床治疗方案提供依据。前期的体内、体外结合实验均已证实RAGE与SLP76两者之间存在相互作用,同时证实这种相互作用具有刺激依赖性。通过对SLP76各结构域及磷酸化位点的功能性研究发现,在RAGE和SLP76过表达的HEK293细胞模型中,SLP76的第145位、第173位酪氨酸以及第207位丝氨酸位点的突变和SAM结构域缺失突变对RAGE-SLP76相互作用有影响。　　 基于实验室前期工作和以上认识,本研究对RAGE和SLP76相互作用介导的下游信号转导通路的激活情况进行了初步研究。研究包括以下两个部分:　　 第一部分:RAGE和SLP76相互作用介导的下游信号转导通路的研究　　 1.首先,为明确RAGE和SLP76是否参与到MAPK信号通路的活化过程,我们将外源性的质粒pcDNA3-HA-RAGE和pcDNA3-Flag-SLP76共转染到RAGE和SLP76表达缺陷的HEK293细胞,并设立转染空载体组和单转染组作为对照,选取实验室前期工作中证明的RAGE和SLP76相互作用活化MAPK最强的时间点10 min作为AGEs的刺激时间,检测细胞内MAPK信号通路的激活情况,这为确定RAGE和SLP76是否参与到MAPK信号通路的活化过程中提供了依据,结果发现,RAGE和SLP76均参与到ERK的活化过程中。　　 2.既然SLP76参与了ERK的活化过程,前期工作通过对SLP76各结构域及磷酸化位点的功能性研究发现:SLP76的第145位、第173位酪氨酸以及第207位丝氨酸位点的突变和SAM结构域缺失突变对RAGE-SLP76相互作用有影响。那么SLP76第145位酪氨酸、第173位酪氨酸及第207位丝氨酸位点的突变和SAM结构域缺失对ERK的活化又会产生什么影响呢?我们将pcDNA3-HA—RAGE和SLP76的四种突变体共转染HEK293细胞,并设立转染空载体组、单转染组和pcDNA3-HA-RAGE和pcDNA3-Flag-SLP76共转染组作为对照,然后给予AGEs刺激10 min,检测细胞内MAPK信号通路的激活情况,结果发现SLP76第145位酪氨酸、第173位酪氨酸及第207位丝氨酸位点的突变对ERK的活化有影响,而SAM结构域缺失突变对ERK的活化无影响。　　 3.RAGE和SLP76在单核巨噬细胞系统皆有表达,这是两者发生相互作用并介导信号通路激活的物质基础和客观条件,而单核巨噬细胞又是炎症反应的重要参与者,因此为了进一步明确细胞中内源性的RAGE和SLP76相互作用的生物学效应,接下来我们用AGEs刺激RAW264.7细胞,检测细胞内MAPKs家族信号通路的激活情况。首先采用免疫印迹western blot研究RAGE和SLP76相互作用介导的下游MAPK信号通路激活的时间效应。实验设立AGEs刺激RAW264.7细胞0 min、1 min、2 min、5 min、10 min、15 min、30 min和60 min组,western blot检测了细胞内MAPK信号通路的激活情况,结果发现ERK和p38均能被激活,且具有不同的时间效应,而JNK在刺激前后激活现象不明显。既然ERK和p38均能被激活,为了进一步探讨其下游信号通路的激活情况,设立了AGEs刺激RAW264.7细胞0 min、10 min、60 min、90 min、120 min和240min组,再采用western blot分析NF-κB通路的激活情况,结果显示IKKα/β在AGEs刺激10 min就开始激活,一直持续到4 h。为分析调控AGEs所激活MAPK通路中的上游激酶,接下来我们用ERK1/2激酶抑制剂PD98059预处理细胞,然后再给予AGEs刺激,western blot检测了细胞内MAPK信号通路受抑制情况,结果显示40μM的PD98059能完全抑制ERK的磷酸化激活；最后利用LiquiChip-液相芯片技术检测AGEs刺激下细胞因子表达谱的变化情况,从而初步探讨了RAGE和SLP76相互作用介导的下游信号转导通路的激活情况,为深入研究这种信号通路的激活在糖尿病慢性并发症等炎症性疾病中的作用奠定了理论基础。　　 4.由以上结果可知,在pcDNA3-HA-RAGE和pcDNA3-Flag-SLP76共转染的HEK293细胞模型中,结果表明RAGE和SLP76均参与到ERK的活化过程中。同时,AGEs刺激能引起RAW264.7细胞内MAPK信号通路中的ERK和p38的磷酸化现象增强,这种磷酸化增强现象是否是由RAGE和SLP76相互作用介导的呢?为进一步证实RAW264.7细胞内源性RAGE和SLP76存在相互作用并参与MAPK信号通路的活化,我们用AGEs刺激RAW264.7细胞1 min,2 min,5 min,10 min,15 min,30 min,60 min七个时间点,并设立不刺激组(0 min组)作为对照,裂解细胞收集细胞裂解液上清。用抗RAGE的抗体耦合蛋白G亲和琼脂糖珠进行免疫共沉淀,将沉淀下来的复合物经SDS-PAGE电泳分离,然后分别采用抗RAGE抗体和抗SLP76抗体进行western blot检测,分析RAGE和SLP76之间的相互作用。　　 第二部分:沉默RAGE基因表达的RNAi慢病毒载体的构建及鉴定　　 RAGE是免疫球蛋白超家族跨膜受体的成员之一,其在结构上由三部分组成,即胞外段、跨膜段和只含有43个氨基酸的短小胞内段,其中胞外段又包含三个免疫球蛋白样结构域,即一个V型结构域紧接两个C型结构域。通过对RAGE结构功能的研究表明V型结构域在结合配体方面起到重要作用,而短小的胞内段在RAGE介导的细胞内信号通路方面起到了关键性的作用,但是目前对于胞内段所参与或激活的胞浆内信号通路的具体分子机制报道很少。我们希望借助慢病毒RNA干扰技术,阻断RAGE和SLP76的相互作用,这对于阐明两者之间的相互作用介导的信号通路具有重要意义。　　 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来发现的一种重要的基因沉默技术,通过转录后的基因沉默方式(post-transcriptional gene silencing,PTGs)来沉默相应基因的表达,由21-23个碱基组成的小干扰RNA(small interference,siRNA)是关键性的作用分子,它可以特异性地与靶基因的mRNA结合导致相应的mRNA降解,最终导致靶基因表达水平的降低,因此RNAi在研究基因的功能及信号转导通路方面具有良好的应用前景。目前,用于沉默基因表达的RNA干扰技术主要有化学合成的siRNA、表达短发夹样RNA(short hairpin,shRNA)的质粒载体和表达shRNA的病毒载体,质粒载体和病毒载体可以在宿主细胞内持续稳定的转录出shRNA,而shRNA可以被内源性的Dicer酶切割成siRNA双链发挥RNAi作用。因此,与siRNA相比,质粒载体和病毒载体可以长时间、稳定的诱导基因沉默,在研究基因功能及信号转导通路方面具有更大的优势。慢病毒是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒(human immunodeficiency virus1,HIV-1)为基础发展形成的一种病毒载体,对分裂细胞和非分裂细胞都具有很强的感染能力,并且慢病毒载体具有低免疫原性及基因整合率高等优点,被广泛用于RNAi和基因表达的载体。　　 我们利用Invitrogen在线软件设计了三条RAGE基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核苷酸(double strand oligo,dS oligo)后克隆到线性的pENTRTM/H1/TO载体的黏性末端,测序。得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组反应,从而获得RAGE基因的真核表达慢病毒干扰载体。在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助复合体和RAGE基因的真核表达慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染PC-3细胞,检验其干扰RAGE基因表达的有效性。　　 通过以上研究,我们得出以下几点结论:　　 1.RAGE和SLP76均参与了ERK的磷酸化激活,RAGE和SLP76的相互作用介导了ERK的活化过程。　　 2.SLP76第145位酪氨酸、第173位酪氨酸及第207位丝氨酸位点的突变对ERK的活化有影响,而SAM结构域缺失突变对ERK的活化无影响。　　 3.内源性的RAGE和SLP76存在相互作用。在AGEs刺激下,能激活RAW264.7细胞内的ERK和p38通路,而JNK在刺激前后不受影响。并且ERK和p38的激活具有不同的时间效应。ERK在不刺激时有微弱磷酸化现象,AGEs刺激5 min时磷酸化开始明显增强,10 min时磷酸化程度达高峰,此后一直持续在磷酸化高水平状态,60 min时磷酸化现象开始衰减。而对于p38,在不刺激时也有微弱的磷酸化现象,AGEs刺激1 min时磷酸化现象就明显激活,此后一直持续在磷酸化高水平状态,30 min时开始出现衰减。　　 4.AGEs刺激RAW264.7细胞,亦能激活MAPK下游的NF-κB信号通路,其激活也具有一定的时间效应,10 min即到达高峰,这种激活状态一直持续到6h；且AGEs刺激可引起RAW264.7细胞因子巨噬细胞炎性蛋白-1α(MacrophageInflammatory Protein-1 alpha,MIP-1α)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosisfactor-alpha,TNF-α)表达量的变化。　　 5.ERK1/2激酶抑制剂PD98059能抑制AGEs刺激引起的ERK和NF-κB的激活。　　 6.成功构建了沉默RAGE基因表达的慢病毒入门载体和表达载体,并成功包装出高滴度的慢病毒,其滴度达8.7×106 U/ml。并检测了慢病毒能成功沉默PC-3细胞中RAGE基因的表达,为进一步探讨在RAGE和SLP76相互作用所激活的信号通路中,RAGE的功能性研究奠定了基础。