SARS-CoV(SARSassociatedcoronavirus)是引起人类严重急性呼吸综合征(SevereAcuteRespiratorySyndromSARS)的病原，为冠状病毒属新成员。该病毒有包膜，基因组为单股正链RNA，编码区基因排序为5-RNA聚合酶(Rep)-S基因-E基因-M基因-N基因-3’，编码RNA聚合酶、S、E、M、N结构蛋白及3a，7a等多个非结构蛋白。SARS-CoV的基因组与氨基酸序列、生物学特性、致病性和流行病学特征不同于传统的人冠状病毒和其它动物冠状病毒，目前对出现这种差异的原因及SARS-CoV的复制和致病机制所知甚少。 病毒通过与宿主细胞发生相互作用，利用宿主的能量和机器来完成自身的复制，同时这些相互作用也往往造成宿主的损伤而使其成为病毒致病机制的重要方面。因此研究病毒与细胞间的相互作用，包括病毒的形态发生及其对宿主细胞凋亡等方面的影响有助于揭示病毒的致病机制，从而为设计有效的治疗药物和研制疫苗提供参考。 为此，本文研究了SARS-CoV在Vero细胞内的超微结构特点、形态发生过程及装配机制，分析了SARS-CoV导致Vero细胞凋亡的机制及凋亡对病毒复制的影响。具体结果如下：1SARS-CoV在Vero细胞内的形态学特点利用负染电镜技术、超薄切片电镜技术以及免疫电镜技术研究了SARS-CoV的形态特点及其形态发生过程。结果显示，该病毒在细胞浆内繁殖。成熟病毒颗粒多为圆形或椭圆形，直径80～120nm，包膜上有放射状排列的纤毛样突起，长约20nm，基底窄。此外可见哑铃形、肾形及“钉子样”等多形性的成熟病毒颗粒，这些颗粒能与病人恢复期血清和抗S抗体反应。细胞内病毒颗粒多位于包涵体内，多形性显著，直径为20～400nm，其形状可分为：1)圆形、肾形或椭圆形，2)管样结构，3)不规则形如三角形、哑铃形，另外可见一种特殊的分枝样颗粒。颗粒电子密度不一，有实心和空心两种，其中空心颗粒周边的电子密度高。 病毒通过膜融合进入细胞，在内质网—高尔基中间膜结构(ERGIC)中出芽、装配，成熟病毒颗粒以囊泡融合的方式运动至细胞表面并释放。包涵体内的病毒能与抗N蛋白抗体反应。观察到病毒螺旋形的核衣壳结构，提示病毒的装配方式可能为核蛋白引导核酸进入已经形成的衣壳内。 病毒的感染对细胞器的影响明显：对膜样结构的影响表现为胞浆内出现大量的小泡样结构、内质网或高尔基体扩张，髓鞘样螺旋结构及双层膜囊泡，囊泡内常充满病毒相关颗粒，髓鞘样结构可能为病毒复制复合体；病毒感染导致细胞核染色质边集等凋亡改变，并引起线粒体不同程度的变性。 2SARS-CoV病毒样颗粒(VLP)的装配为了阐明SARS-CoV的装配机制和各结构蛋白的相互作用，我们构建了表达SARS-CoV结构蛋白的重组杆状病毒。获得了单独表达结构蛋白S(opt)、E(opt)、M(opt)和N的杆状病毒载体及同时表达ES、EM、EM-FLAG的杆状病毒双表达载体，在昆虫细胞中成功表达了SARS-CoV的这些结构蛋白，随后用用不同的杆状病毒感染Sf9细胞，观察病毒样颗粒的形成规律。我们发现：(1)单独表达任何SARS-CoV结构蛋白均未在胞浆内明确观察到VLP的形成。(2)E、M蛋白或E、M-FLAG蛋白共表达能在细胞内形成空心VLP，颗粒大小及电子密度不一，前者组装成VLP的效率较高。M蛋白羧基端的FLAG标签不影响其与E蛋白的作用。E、S蛋白共表达形成VLP的效率低，在胞浆中不易找到。 (3)E、M与N蛋白的共表达及E、M与S蛋白的共表达均可形成VLP。 3SARS-CoV对Vero细胞凋亡的影响研究表明，SARS病人体内存在细胞过度凋亡的现象，提示凋亡可能是病毒致病机制之一。我们将SARS-CoV感染Vero细胞，Hoechst33258染色可见细胞核染色质浓集，DNALadder实验发现感染12h后的Vero细胞DNA片段化、出现DNALadder，提示该病毒感染能导致Vero细胞的凋亡 进一步对细胞凋亡与病毒复制关系的研究表明，用紫外线灭活病毒(这种病毒有吸附细胞的能力，但丧失了复制能力)感染的Vero细胞不发生凋亡，只有活病毒感染的细胞才发生凋亡，凋亡细胞数随活病毒感染时间的增加、病毒蛋白合成的增加及病毒产量的增加而增多，说明SARS-CoV导致的细胞凋亡与病毒的复制相关。 SARS-CoV感染Vero细胞后12h和24h可检测到明显的Caspase3活性亚基条带，用抑制剂处理后活性亚基条带消失，细胞也无明显的凋亡现象，但用抑制剂处理后的病毒滴度没有明显下降，提示SARS-CoV导致的Vero细胞凋亡为Caspase依赖性的，抑制Caspase不影响病毒的复制。另外Bcl-2和Bax蛋白表达分别出现降低和增加的变化，提示线粒体信号传导途径中Bcl-2家族的成员可能参与了SARS-CoV导致的Vero细胞凋亡。 为进一步分析SARS-CoV编码蛋白在诱导细胞凋亡中的作用，我们构建了表达SARS-CoVS、N、M、E等结构蛋白和3a、7a等非结构蛋白的表达质粒，转染Vero细胞后24h、48h可检测到S、N、M、3a和7a的表达。通过DNALadder和Caspase3活性检测等实验，分别对其诱导凋亡的能力进行了分析，发现7a在转染后24、48h均可诱导细胞凋亡，而E在转染后24h，S、3a在转染后48h也可诱导凋亡，E、S、3a与细胞凋亡的关系还有待进一步研究。 综上所述，本文研究了SARS-CoV病毒颗粒独特的多形性特征，部分阐明了病毒的复制特点、装配机制和诱导Vero细胞凋亡的机制，这些工作将为深入探讨病毒的致病机制和设计抗病毒药物提供线索。对于病毒形态的研究还可为病毒鉴别诊断提供参考。