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柑橘绿霉病菌(Penicillium digitatum)引起的柑橘腐烂病是贮藏期最主要病害,在柑橘采后包装、储存、运输和销售等过程中,造成的损失约占全部损失的90%。本研究利用农杆菌介导的真菌转化系统,通过基因功能缺失和互补的方法,研究了柑橘绿霉病菌中pH信号途径转录因子PacC, Ca2+/钙调素信号途径转录因子Crz1以及蔗糖非发酵蛋白激酶SNF1在柑橘绿霉病菌发育和致病等过程中的作用,结果如下：1.PdPacC参与柑橘绿霉病菌响应Na+胁迫、利用果胶和致病性序列比对和分析发现柑橘绿霉病菌中存在与构巢曲霉(Aspergillus nidulans)类似的pH信号响应途径,该信号途径的末端转录因子PdPacC含有641个氨基酸,存在与构巢曲霉AnPacC相似的3个锌指结构域(57～145位,从起始密码子起,下同)以及信号蛋白酶识别位点(461～484位),在启动子区(-222bp到-723bp)含有4个PacC自身结合位点(5’-GCCARG-3’)。表达分析表明中性和碱性条件(pH≥7)、Na+胁迫和果胶处理均可诱导(?)dPacC,而在侵染过程中其表达不受果皮酸性pH环境影响,在感染初期呈现明显的升高,48后为对照条件(PDB中培养)的8.4倍(?)PdPacC缺失突变体对Na+、K+的敏感性增加,丧失在碱性条件(pH=8.0)下的生长能力,对果胶的利用能力下降,对柑橘果实的致病能力也显著下降,产生的病斑直径只有野生型的56.3%。而将功能PdPacC重新导入缺失突变体时,缺失突变体表型缺陷恢复。试验还发现,在侵染过程中与野生型相比△PdPacC突变株内切多聚半乳糖醛酸酶(PG2)和果胶裂解酶(PNL1)的上升表达丧失,进一步分析表明ΔPG2突变株引起的病斑直径只有野生型的70%。综上所述,PdPacC参与对Na+、K+及碱性胁迫的适应,并通过调控细胞壁水解酶影响致病性。2. PdCrzl参与柑橘绿霉病菌的产孢、细胞壁合成、致病和对DMI类药剂的抗性转录因子Crz1是受钙调磷酸酶调控的Cys2His2锌指转录因子,能够响应外界的环境胁迫。本研究结果表明,柑橘绿霉病菌中的Crzl基因能够编码760个氨基酸的蛋白,其C末端含有2个保守的Cys2His2型锌指结构域(522～574位)。△PdCrz1突变株的产孢能力、致病性下降,对刚果红、SDS和细胞壁降解酶的敏感性增加,且细胞壁松散。同时,△PdCrz1突变株对Ca2+和H202的敏感性增加。表达分析表明Ca2+能够诱导野生型中钙离子ATP酶基因PMC1和PMR1,细胞壁合成酶基因FKS1、CHS2和CHS3的表达,而在△PdCrz1突变株中这些基因的上调表达丧失。△PdCrz1突变株对DMI类杀菌剂的敏感性增加,钙调磷酸酶抑制剂能够增强DMI类杀菌剂的活性,而且低浓度的Ca2+(≤0.2M)能够提高柑橘绿霉病菌对DMI类杀菌剂的抗性。这些结果表明PdCrz1对柑橘绿霉病菌的产孢、致病性以及DMI类杀菌剂的抗性有重要的作用,钙调磷酸酶信号途径的抑制剂与DMI类药剂具有协同的抗菌作用,表明钙调磷酸酶信号途径的抑制剂可作为DMI类杀菌剂的增效剂具有潜在的应用价值。3.PdSNF1参与柑橘绿霉病菌的碳源利用、产孢和致病性蛋白激酶SNF1能够激活葡萄糖抑制基因的表达,对病原微生物适应外界环境的营养胁迫和致病性有重要的作用。本研究表明,柑橘绿霉病菌中的SNF1基因能够编码789个氨基酸的蛋白,其N端含有一个保守的蛋白激酶区(65～316位)。△PdCrz1突变株在含有果胶或多聚半乳糖醛酸的单碳源培养基上生长严重缺陷,对柑橘果实的致病性下降,接种5d后的病斑直径只有野生型菌株的63%。表达分析表明经60h的果胶诱导培养,野生型菌株中细胞壁水解酶：木聚糖酶(XY1)、果胶酶(PL1)、果胶裂解酶(PNL1)和外切多聚半乳糖醛酸酶(EXPG2)的表达分别升高15.5、12.9、21和12.3倍,而△PdCrz1突变株中这些细胞壁水解酶的表达没有被诱导升高。由此可见,PdCrz1极可能通过调控细胞壁水解酶而调控对果胶等碳源的利用,从而影响致病性。此外还发现,在PDA培养基和接种果实上,△PdCrz1突变株的产孢能力均显著下降,只有野生型的10%。观察发现,△PdCrz1突变株的分生孢子梗90%不能形成指状分枝,直接产生孢子,表达分析表明△PdCrz1突变株中的分生孢子梗形成关键基因BrlA的表达受到严重影响,可见PdCrz1对产孢的作用是通过调节BrlA的表达引起的。