研究背景：急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是由Ashbaugh和他的同事在1967年首次报道的,最初命名为成人呼吸窘迫综合征(adult respiratory distress syndrome, ARDS),但由于该病在小儿亦可出现,因此1994年美欧ARDS联席会议(AECC)决定将其更名为急性呼吸窘迫综合征。ARDS是急性肺损伤(acute lung injury, ALI)的严重表现形式,ALI/ARDS是继发于非心源性疾病的严重呼吸系统疾病,由于现代复苏技术和危重疾病早期抢救水平的提高,危重病人早期死亡率降低,ALI/ARDS发病率却随之增加,儿童重症监护室(PICU)中的发病率约为1.0%-4.2%。虽然肺保护性通气策略等现代治疗手段可以在一定程度上改善通气血流比例失调,改善氧供,但并不能降低ALI/ARDS死亡率, ALI/ARDS仍是PICU中威胁儿童生命的重要原因之一,死亡率高达54.6%-62.9%。ALI/ARDS是以弥漫性肺细胞损伤为基础,以肺血管损伤所致的肺水肿和肺组织炎性细胞浸润为其病理特征,临床上以严重的低氧血症、弥漫性肺浸润和肺水肿为主要特征的疾病。其发病机制复杂,尚未完全明确,但目前认为主要包括以下几方面：1、肺水肿的形成。普遍认为由两方面因素所导致：一方面是由于肺泡上皮和毛细血管上皮通透性增加,其肺泡液转运功能受损,使得蛋白水肿液聚集在肺泡腔内；另一方面是水通道蛋白的数量和功能的异常。水通道蛋白主要包括AQP-1、AQP-3、AQP-4和AQP-5。其中AQP-1对肺内液体的吸收及转运方面起重要的作用。ALI/ARDS的发生过程中,肺泡Ⅱ型细胞上AQP-1的表达减少,造成肺间质和肺泡内的水经由水通道蛋白重吸收的减少,水在肺间质和肺泡聚集形成肺水肿。2、肺组织广泛而过度的炎性反应。ALI/ARDS的本质就是炎症反应失控,诸多实验证据表明多形核白细胞(PMN)在绝大多数ALI/ARDS的发病机制中起关键作用。PMN介导的氧化应激反应、蛋白水解酶释放及其细胞毒素使肺血管内皮和肺泡上皮受损,大量富含蛋白的液体进入肺组织,导致肺水肿、透明膜的形成及肺泡塌陷。此外,细胞因子的大量释放、促炎因子与抗炎因子失衡,均是导致ALI/ARDS的重要原因。3、Ⅱ型肺泡上皮受损使表面活性物质合成减少,成分改变。肺表面活性物质在肺泡液-气界面形成单分子层,起到降低肺泡表面张力的作用,对维持肺泡正常结构和稳定通气具有重要作用。因此,肺表面活性物质减少或成分改变均会导致肺泡塌陷,出现低氧血症等严重症状。4、凝血功能异常:ALI/ARDS发展过程中在凝血及纤溶级联反应的失调已经被证实,ALI/ARDS患者肺血管内常出现血小板纤维素性微血栓,血管外纤维素沉着,这可能是ALI/ARDS患者频发多器官功能衰竭的重要原因,研究还发现弥散性血管内凝血(DIC)与病程严重程度相关。ALI/ARDS尚无特效治疗手段,目前临床上多根据其病理生理改变和临床表现,采取综合性治疗措施。主要治疗措施有：1、积极治疗原发病及全身营养支持：尽早去除或控制致病因素,遏制其诱导的全身失控性炎症反应是ALI/ARDS病因治疗的首要措施。全身综合支持治疗,如预防感染、营养支持、胃肠道保护、预防血栓栓塞等可以防止患者病情加重甚至多器官功能障碍综合征的发生。2、机械通气治疗：通气疗法是纠正缺氧的主要措施。近年来,通气疗法取得了显著的进步,特别是肺保护性通气策略(小潮气量：6ml.kg-1)可以有效的改善肺泡通气、提高PaO2、改善动脉氧合,并且能避免呼吸机相关性肺损伤的发生。3、一些药物,如外源性肺表面活性物质、糖皮质激素、蛋白酶抑制剂、祛痰药物等,在改善通气血流比例,改善血氧方面也起着一定作用,但这些药物并不能降低ALI/ARDS病人的死亡率。自1993年,Lee等在秀丽新小杆线虫中发现了第一个microRNA (miRNA)以来,miRNA一直是各领域研究的热点,2002年,更是被美国著名杂志《Science》评为十大科技突破的第一条。miRNA是一类非编码单链小分子,通过与靶信使RNA (mRNA)特异性的碱基互补配对,引起靶mRNA降解或者抑制其翻译,从而对基因进行转录后的表达调控。miRNA在各个层面生命过程中起调节作用,涉及细胞发育、生长、分化、凋亡,组织发育,关键蛋白的分泌等。近年来的研究显示miRNA参与多种疾病的病理生理过程,如心血管疾病、肿瘤生成、神经系统疾病等,并发现：miRNA与肺的生长发育及肺部疾病的发生发展及转归有着密切的关联,如肺部肿瘤、肺纤维化、肺炎等。国内外对miRNA在ALI/ARDS发生发展中所起的作用研究的甚少,主要集中在感染、免疫、肺损伤等方面。生物芯片是一种具有高通量、高集成、微型化、连续化和自动化特点的新技术。所谓生物芯片一般指高密度固定在互相支持介质上的生物信息分子(如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白质、糖分子、组织等)的微阵列杂交型芯片,阵列中每个分子的序列及位置都是已知的,并且是预先设定好的序列点阵。miRNA芯片已熟练应用于检测和比较正常组织和疾病组织中miRNA的表达谱,并且通过生物信息学分析其调控的靶基因可以深入分析其调控机制或生物学功能,对疾病诊断和新的治疗有启示性作用。过去研究中,虽然在基因及信号通路方面对ALI/ARDS发病机制及病理生理过程进行了深刻的探索,但仍尚未完全明了。因此进一步探寻ARDS发病机制及病理生理过程是亟待解决的医学难题,具有重要的理论意义和临床价值。基于以上理论,本研究拟采用通过气管内注入脂多糖的方法构建小鼠ALI/ARDS的模型,通过观察小鼠一般情况、呼吸频率,肺组织干湿重比、病理组织切片等方法评价模型成功与否；用生物芯片的方法分析ALI/ARDS小鼠肺组织的miRNA表达谱,筛选出差异表达的miRNA,用生物信息学方法对差异表达的miRNA进行靶基因预测,并对其进行深度分析,初步探讨差异表达的miRNA及其靶基因对ALI/ARDS的调控机制,为进一步完善ARDS的发病机制及ARDS的治疗提供新的思路。目的：1、通过气管向肺内滴注脂多糖(LPS),构建小鼠ALI/ARDS模型。2、采用芯片技术研究LPS诱导的小鼠ALI/ARDS肺组织中miRNA的表达谱,筛选出差异表达的miRNA,为进一步探讨miRNA在ALI/ARDS发生机制中的作用提供依据。3、用生物信息学方法预测差异表达miRNA的靶基因,并对其进行深度分析,找出与ALI/ARDS病理生理过程密切相关的miRNA及其靶基因。方法：C57BL小鼠24只,随机分为实验组和对照组,每组各12只。实验组小鼠通过气管切开经气道向肺内注入LPS (6mg·kg-1),构建小鼠ALI/ARDS模型。对照组用同样的方法注入相应剂量的生理盐水,所有小鼠均于手术后24小时放血处死。术后观察小鼠一般情况、呼吸频率等,取左肺组织用于测量干湿重比,右中肺叶行HE染色观察病理变化。应用miRNA芯片技术检测对照组及ALI/ARDS组小鼠肺组织]miRNA表达谱的差异,选取其中差异较明显的miRNA通过查询互联网上miRNA靶基因预测软件(TargetScan, miRanda, Clip-seq, miRDB)进行靶基因预测,并以三个或三个以上软件共同预测结果作为microRNA的候选靶基因。将预测的靶基因进行Gene Ontology分析,并用Gather KEGG进行相关信号通路分析。结果：1、和对照组相比,实验组小鼠精神萎靡,食欲差,被毛竖立,活动差,嘴唇青紫,呼吸频率明显增快。其次,肺组织干湿重比明显增高。最后肺组织病理切片结果显示部分肺泡间隔破坏,有明显的炎性细胞浸润,符合ALI/ARDS的病理改变。2、芯片结果显示ALI/ARDS小鼠肺组织中明显差异表达的miRNA有48个,其中上调的有27个,包括miR-574-5p, miR-483-5p, miR-711, miR-30c-1-3p, miR-92a-2-5p, miR-709, miR-466j, miR-690, miR-1902, miR-1897-5p, miR-1940,miR-1894-3p, miR-3099-3p, miR-1249-5p, miR-149-3p, miR-193b-5p, miR-3087-5p, miR-3102-5p, miR-3473, miR-466m-5p, miR-504-3p, miR-5107, miR-5110, miR-5115, miR-5132, miR-669f-5p, miR-423-5p。下调的有21个。miR-98-5p, let-7a-5p, miR-146b-5p, miR-200a-3p, miR-30b-5p, miR-145-5p, miR-130a-3p, miR-15a-5p, miR-467c-5p, miR-18a-3p, miR-133a-3p, miR-151-3p, miR-16-5p, miR-24-3p, miR-30d-5p, miR-34c-5p, miR-23a-3p, miR-3472, let-7g-5p, miR-3473b, miR-5128。3、应用靶基因预测软件预测得到let-7a-5p, miR-16-5p, miR-24-3p, miR-146b-5p的靶基因分别有267,46,374和137个。应用GO进行靶基因富集、分类,分析查找与炎症、肺发育、凋亡等相关的基因靶点,结果显示,let-7a-5p靶基因中与炎症相关的靶基因有48个,与凋亡相关的靶基因有16个,与肺发育相关的靶基因有6个；miR-16-5p靶基因中与炎症相关的靶基因有23个,与凋亡相关的靶基因有12个,与肺发育相关的靶基因有4个；miR-24-3p靶基因中与炎症相关的靶基因有20个,与凋亡相关的靶基因有7个,与肺发育相关的靶基因有17个。对这些候选靶基因集进行KEGG生物通路分析,从而找出最相关的生物通路上的靶基因。这些信号通路包括MAKP信号通路、Toll样受体信号通路、TGF-β信号通路等。结论：通过气管经气道向肺内注入LPS能成功构建小鼠ALI/ARDS模型,miRNA在ALI/ARDS小鼠模型肺组织中发生了明显的变化,这些差异表达的miRNA的靶基因涉及炎症、肺发育、细胞凋亡等,提示miRNA在ALI/ARDS病理生理过程中起重要作用。