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小菜蛾Plutellaxylostella(Lepidoptera:Plutellidae)是世界性十字花科蔬菜上的主要害虫,每年全世界的蔬菜由于其为害而造成的经济损失达10亿美元。由于小菜蛾生活史的特殊性,它对各种不同类型的杀虫剂的抗药性水平逐年上升,其抗药性的治理己成为目前非常棘手的问题,小菜蛾也成为世界上最难防治的害虫之一。本论文从中国几个小菜蛾野外种群对马拉硫磷的抗药性监测开始,研究了马拉硫磷对小菜蛾的抗药性选育、抗性种群和敏感种群之间羧酸酯酶活性的变化,利用淀粉凝胶电泳分析了小菜蛾抗性种群和敏感种群之间酯酶同工酶谱的差异以及它们之间的遗传多态性差异,最后从分子生物学方面对小菜蛾对有机磷杀虫剂的抗药性机理进行了初探,为进一步从分子水平明确其抗药性产生的真正机理奠定了重要的基础。主要研究结果和结论如下:
室内利用浸叶法,以室内敏感种群的小菜蛾作为对照,监测了中国的北京、河南、南京、武汉和福建地区小菜蛾种群对马拉硫磷的抗药性,结果发现,福建小菜蛾种群对马拉硫磷的抗性倍数为61.78倍,为高抗性水平,南京小菜蛾种群抗性水平次之,达30.64倍,这2个小菜蛾种群已不能用马拉硫磷来防治;北京和武汉小菜蛾种群的抗性倍数分别为7.85倍和3.37倍,尚属于低抗性水平;而河南小菜蛾种群对马拉硫磷还处于敏感状态,可以用马拉硫磷来适时防治。
室内采用喷雾法用马拉硫磷对敏感小菜蛾进行抗性选育,经过选育17代,抗性倍数达35.12倍,抗性上升曲线呈现指数上升的特点。对南京野外种群、抗性和敏感的小菜蛾品系的全酯酶和羧酸酯酶活性进行了测定,发现抗性种群的羧酸酯酶和全酯酶的活性相对于敏感种群都有一定程度的升高。以α-NA为底物时,抗性选育种群和南京野外种群的酯酶活性与敏感种群差异显著,而选育种群与南京自然种群的解毒酶之间活性无显著差异。以β-NA为底物时,实验所用的3个种群的酯酶之间均存在显著差异,其中以南京种群的酯酶活性最高。
利用淀粉凝胶电泳对敏感和抗性小菜蛾品系、南京和河南小菜蛾种群的酯酶同工酶的多态性及其之间的遗传差异进行了分析,结果表明2个野外小菜蛾种群的酯酶多态性较强,敏感种群的酯酶同工酶的多态性也比较强,而抗性选育种群的酯酶位点比较单一,基因型由杂合型逐渐向纯合型过渡,其中EST-4位点由于纯合子过量而显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P=0.0079)。从遗传距离D分析,抗性选育种群在药剂的选择压力之下,与其它各种群之间的遗传差异较大。
通过分析相关昆虫种间的氨基酸序列的保守性,利用CodeHop软件设计简并引物,采用RT-PCR方法,首次从对有机磷杀虫剂产生抗性的小菜蛾品系中克隆到5个序列不同的位于羧酸酯酶基因上游的片段,大小约为420bp,已分别在GenBank上注册,序列检索号为AY044242、AY184969、AY184970、AY184971和AY184972,经BLAST比较,该基因片段与双翅目蚊虫的序列相似性达86%以上,此结果为深入研究小菜蛾抗药性的分子机理奠定了基础。
在获得羧酸酯酶基因片段的基础上设计基因特异性引物,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术试图扩增羧酸酯酶全长基因,3’端未能获得预期的条带,5’端扩增到一条单一的DNA条带,经克隆、测序之后,BLAST比较结果表明该基因是小菜蛾核糖体蛋白S13基因的全长cDNA序列,具有完整的阅读框、起始密码子和终止密码子,目前已在GenBank上登录,序列检索号为AY174891。
比较小菜蛾与其它昆虫种间的核糖体蛋白S13基因的氨基酸序列相似性,结果发现此基因在鳞翅目昆虫中的保守性很强,可能与其在生物进化中的重要功能有关。利用PHYLIPver.3.6a3构建了包括小菜蛾在内的几种昆虫和其它生物之间的系统发育树,聚类结果符合生物由低等向高等进化的历程,说明核糖体蛋白S13基因从进化上来说,既具有生物的保守性,又反映了生物进化的发展历程,可在一定程度上为生物的系统进化研究提供一种很有前景的分子标记方法。