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目的与背景:儿童早老症(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome,HGPS)是一种非常罕见的遗传疾病。经研究发现:HGPS 是由于LMNA 基因在其外显子11的第1824位发生核苷酸替代(C→T),尽管未造成氨基酸残基的改变(G608G),但产生了一个潜在的剪切位点,产生截短50个氨基酸的蛋白所致。Zmpste24 缺失基因(Zmpste24<'-/->)小鼠,导致未加工的A型核纤层蛋白前体(prelamin A)的大量堆积。Zmpste24<'-/->小鼠具有HGPS病人所表现出的很多典型性早衰的现象,我们预测 prelamin A可能通过与其他的相互作用蛋白来引起细胞的早衰,所以欲用酵母双杂交系统以 prelamin A的C末端为诱饵蛋白筛选出其相互作用蛋白。
方法:通过PCR扩增pTracer-CMV-PLA 质粒获得A型核纤层蛋白前体的C末端cDNA(1165~1995bp),将NdeⅠ+EcoR Ⅰ双酶切的PCR产物连接同样双酶切的载体pGBKT7构建成pGBKT7-PLA-C质粒(BD诱饵质粒)。将pGBKT7-PLA-C质粒转到酵母 AH109中,观察到prelamin A的C末端对酵母AH109 毒性,检测prelamin A 的 C末端对报告基因的自主激活活性。将构建于pACT2质粒(酵母双杂交中的AD质粒)的人骨骼肌细胞cDNA 文库酵母菌Y187与含成功构建的BD 质粒的酵母菌AH109杂交融合后得到初筛候选阳性克隆,从这些候选克隆中,通过转化大肠杆菌JM109获得单一文库质粒,再进行自主激活报告基因检测和一对一回复性杂交实验,最后筛选出真阳性克隆(即与人A型核纤层蛋白前体蛋白相互作用的蛋白)。经上述一对一回复确证为阳性相互作用的AD质粒,以pACT2质粒的通用引物为测序引物测定该质粒的插入片段cDNA序列。通过国际互联网络,以美国国立生物信息中心(NCBI)的BLAST作为主要的检索工具,检索主要程序采用BLAST,对相互作用蛋白的cDNA 序列进行同源性分析,最终确定该相互作用蛋白的名称。
结果:成功构建pGBKT7-PLA-C 穿梭质粒,构建诱饵酵母株 AH109[pGBKT7-PLA-C],证实prelamin A的C末端对酵母AH109没有毒性和报告基因自主激活活性。经酵母双杂交实验,筛选出七种与prelaminA的C末段相互作用蛋白,核酸序列分析及同源性检索结果为:①人triadin蛋白;②人慢型肌球蛋白结合蛋白C;③人分选、装配结构元件;④金属硫蛋白2A;⑤环指蛋白1;⑥亚甲基四氢叶酸脱氢酶(依赖 NADP<'+>);⑦人丝蛋白C。