目的：　　1、检测临床乳腺癌样本和对应癌旁组织、不同人乳腺癌细胞中miRNA-29b的表达水平，从而确认miRNA-29b的表达与乳腺癌患者临床指标的关联性以及在不同乳腺癌细胞中的表达差异。　　2、探索miRNA-29b对乳腺癌细胞增殖、侵袭转移能力的调控作用。　　3、探讨miRNA-29b调控乳腺癌细胞恶性生物学行为的具体机制。　　方法：　　1、采用Real-time PCR检测66例临床乳腺癌组织和对应癌旁组织中miRNA-29b的表达情况，收集患者的临床病例资料并进行关联性分析；并分析人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、T47D、BT-474和BT-20及人正常乳腺上皮细胞株HBL-100细胞中miRNA-29b的表达情况；　　2、构建miRNA-29b过表达的慢病毒载体，转染人乳腺癌细胞系MCF-7和T47D提高其miRNA-29b的表达水平。采用CCK-8、Transwell侵袭迁移实验和裸鼠皮下瘤移植实验检测miRNA-29b对乳腺癌细胞增殖以及侵袭、转移能力的影响。　　3、采用生物信息学软件对miRNA-29b调控的下游靶基因进行预测和筛选。然后使用双荧光素酶报告基因实验、Real-time PCR和western blot进行实验验证。采用RNA干扰技术降低乳腺癌MCF-7细胞中RTKN的表达，观察其对乳腺癌细胞增殖、侵袭以及迁移能力的作用，从而对miRNA-29b的调控靶点进行深入的探索　　结果：　　1、Real-time PCR结果显示，在不同的人乳腺癌细胞系中，miRNA-29b的表达存在不同；与人正常乳腺上皮细胞株HBL-100细胞相比，5种人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、T47D、BT-474和BT-20中miRNA-29b表达水平均出现显著降低（p＜0.05），其中MCF-7细胞中miRNA-29b的表达水平最低，下降至46.3±4.21%（p＜0.01）。随后对66例乳腺癌患者的乳腺癌组织和相应癌旁组织中miRNA-29b的表达状况进行检测，结果显示，乳腺癌组织中miRNA-29b的表达水平下降至0.365±0.042，与癌旁组织相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　2、单因素分析的结果显示，乳腺癌患者的ER受体、PR受体及miRNA-29b的表达与患者预后密切相关。多因素COX回归分析结果证实，miRNA-29b高表达对乳腺癌生存期的风险比(HR）=0.298，P=0.004，而ER，PR对患者的生存时间无影响，证实miRNA-29b是影响乳腺癌患者生存预后的独立因素。　　X2检验显示，年龄大于60岁或小于60岁，HER2表达阳性或阴性，患者的乳腺癌组织中miRNA-29b表达水平无差异（p＞0.05）。而miRNA-29b表达水平与乳腺癌患者T分期、N分期、ER受体、PR受体呈显著相关。miRNA-29b在T、N分期越高、ER受体阴性和PR受体阴性的患者中性表达低（p＜0.05）。　　3、构建miRNA-29b慢病毒载体感染MCF-7和T47D乳腺癌细胞，转染miRNA-29b的慢病毒载体（Lenti-miRNA-29b）或空白载体NC（Lenti-miRNA-NC）感染乳腺癌细胞MCF-7和T47D后，可见约90%以上的乳腺癌细胞出现绿色荧光，而空白载体组细胞（未感染慢病毒载体）无绿色荧光表达，证实miRNA-29b慢病毒载体感染成功。　　4、感染Lenti-miRNA-29b的慢病毒后，MCF-7与T47D乳腺癌细胞中miRNA-29b的表达水平出现显著增加。其中，在MCF-7细胞中miRNA-29b表达增加24.63倍，在T47D细胞中miRNA-29b表达增加18.35倍，差异具有统计学意义（P＜0.05）。CCK-8的增殖实验结果显示，感染Lenti-miRNA-29b组的两种乳腺癌细胞（MCF-7细胞与T47D细胞）从细胞培养开始的第三天，其细胞增殖能力出现显著的下降，明显低于空白对照组细胞（P＜0.05）。平板克隆实验结果与此趋势一致，与感染Lenti-miRNA-NC组的乳腺癌细胞相比，Lenti-miRNA-29b组乳腺癌细胞克隆数显著降低。　　结果表明，miRNA-29b表达增强能够显著抑制MCF-7和T47D乳腺癌细胞的增殖和克隆形成能力（P＜0.05）。　　随后我们采用H&E染色和Ki67染色对皮下肿瘤组织进行分析，H&E染色证实了皮下肿瘤的形成。免疫组化染色结果显示，miRNA-29b过表达MCF-7细胞所形成的皮下肿瘤组织Ki-67染色显著弱于空白对照组细胞，表明miRNA-29b过表达的乳腺癌细胞的增殖能力显著低于空白对照细胞，在体内研究中进一步证实miRNA-29b能够抑制乳腺癌细胞的增殖能力。　　5、通过使用多种生物信息学预测软件（TargetScan、miRanda和miRWalk）对miRNA-29b可能的下游靶基因进行预测。筛选得到了RTKN作为下游靶点开展后续研究。首先是生物信息学软件的分析结果证实，在RTKN的基因编码3UTR区中具有miRNA-29b的结合位点，表明RTKN可能是miRNA-29b的调控靶点。　　为了验证RTKN是否为miRNA-29b调控的直接靶基因，我们构建了含有野生型RTKN3UTR区和突变型RTKN3UTR区的荧光素酶报告基因载体，分别命名为RTKN-WT-3UTR和RTKN-MUT-3UTR。通过测序的结果显示，构建的序列正确。　　采用双荧光素酶报告基因实验验证RTKN是否为miRNA-29b调控的下游靶基因。　　结果显示，野生型RTKN-WT-3UTR报告基因载体与Lenti-miRNA-29b共转染MCF-7细胞后可使荧光素酶的活性出现显著下降，而Lenti-miRNA-29b与突变型RTKN-MUT-3UTR报告基因的载体共转染MCF-7细胞后荧光素酶的活性无显著变化（P＜0.05）。该结果提示，miRNA-29b能与RTKN3UTR区的结合位点结合，RTKN可能是miRNA-29b调控的下游直接靶基因。　　为了进一步验证RTKN是miRNA-29b的下游靶基因，首先通过Real-time PCR检测了miRNA-29b过表达对乳腺癌MCF-7细胞中RTKN mRNA的表达水平的作用。MCF-7细胞中miRNA-29b过表达后能够显著降低RTKN mRNA的表达水平（P＜0.05，与Lenti-miRNA-NC组相比）。Western blot结果与PCR检测结果趋势一致，miRNA-29b过表达后导致MCF-7细胞中RTKN蛋白水平的表达显著下降（P＜0.05）。　　结果证实，miRNA-29b能够抑制乳腺癌MCF-7细胞RTKN的表达，RTKN是miRNA-29b的调控的下游靶基因。　　6、为了研究miRNA-29b抑制乳腺癌细胞的恶性生物学行为是否通过调控RTKN的表达来实现，我们构建了RTKN siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞干扰RTKN的表达，从而研究其对乳腺癌细胞生物学行为的作用。　　结果显示，3条siRNA均能有效抑制乳腺癌细胞中RTKN mRNA，其中si-RTKN-3抑制效率最高（P＜0.05）。Western blot结果与此一致，转染si-RTKN的三组细胞中RTKN蛋白的表达水平显著降低，si-RTKN-3的抑制RTKN效率最高，差异具有统计学意义（P＜0.05，与si-NC组细胞相比）。　　CCK-8增殖实验结果显示，RTKN表达下降乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力显著降低（P＜0.05）。平板克隆实验结果与此趋势一致。RTKN表达下降导致了乳腺癌细胞的克隆形成能力的下降（P＜0.05）。Transwell实验结果显示，与空白对照组相比，RTKN表达干扰的乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力均出现了显著的减弱（P＜0.05）。以上结果证实，RTKN表达下降能够抑制乳腺癌细胞功能。　　我们进一步证实RTKN表达降低对过表达miRNA-29b的乳腺癌细胞恶性表型抑制作用的影响。CCK-8增殖实验显示，miRNA-29b过表达能够抑制乳腺癌细胞的增殖，而抑制RTKN的表达后能够进一步地增强miRNA-29b的抑制作用（P＜0.05）。平板克隆实验与此结果趋势一致，RTKN表达下降进一步地增强miRNA-29b抑制乳腺癌细胞克隆形成的作用（P＜0.05）。Transwell实验显示，miRNA-29b过表达能够抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力，而MCF-7细胞中下调RTKN的表达后，细胞侵袭和迁移能力进一步下降（P＜0.05）。以上结果进一步证实，miRNA-29b可能通过靶向调控RTKN的表达进而抑制乳腺癌细胞的恶性生物学行为。　　结论：　　1、miRNA-29b在乳腺癌组织的表达出现显著降低，并且miRNA-29b的异常表达与乳腺癌的恶性表型特征以及患者预后密切相关。　　2、miRNA-29b表达增强能显著抑制乳腺癌癌细胞的增殖、侵袭和转移能力，并且在体内抑制乳腺癌癌细胞的皮下成瘤能力。　　3、RTKN是miRNA-29b调控的下游靶基因，miRNA-29b能够通过抑制RTKN的表达来抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭以及转移能力。因此，miRNA-29b-RTKN有可能成为乳腺癌治疗的作用靶点。