论文部分内容阅读
目前全球有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染者约3.5~4亿,其中每年约有1%的患者进展为乙型重型肝炎(severe hepatitis B,SHB)。在乙型病毒性肝炎免疫损伤的研究发现,机体的T细胞免疫分为两大类,一类是迟发性超敏反应,效应细胞是CD4+T细胞(T-helper lymphocyte),受MHC- II类分子限制,通过释放多种细胞因子(lymphokine)诱导炎症反应而损伤肝细胞;另一类是T细胞毒反应,其效应细胞是CD8+细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL),受MHC-I类分子限制,通过释放穿孔素、颗粒酶及淋巴因子而导致肝细胞损伤。其中,乙型肝炎患者肝内坏死区浸润的淋巴细胞主要是CD8+CTL,这就提示CD8+CTL所致的细胞毒性反应在肝脏的免疫病理损伤中起着主要作用。因此,要诱导肝细胞损伤的决定因素至少有三个,即CD8+T细胞大量浸润入肝脏、肝细胞膜上表达乙型肝炎核心抗原(HBcAg)以及肝细胞膜上表达MHC-I类分子。一系列地证据均支持MHC-I类限制性细胞毒性T细胞破坏病毒感染的肝细胞是导致肝脏损伤的主要作用,但关于病毒特异性CD8+T细胞介导的免疫应答是否是引起重型肝炎肝脏免疫损伤的主要原因尚有争议。在外周血和动物实验中发现,CD8mRNA在肝内的水平增加程度与血清ALT水平一致,而有关病毒特异性CD8+T细胞与血清ALT之间关联性的结论则各不相同。不足的是,由于样本获得困难及实验技术限制,目前有关乙型重型肝炎的发病机制研究多局限于外周血及动物模型,对肝脏内T细胞亚群与肝脏免疫损伤的关系未进行深入探索,使上述研究难以直接、真实地反映肝脏内部的免疫应答状态。以往关于病毒性肝炎的免疫损伤研究多从免疫细胞的数量、功能与肝脏免疫病理之间的关系等方面展开的,有关调节免疫细胞分泌和杀伤功能的更为深入的机制研究很少。近年来的研究发现,K+、Ca2+离子通道在淋巴细胞的免疫功能调节中具有重要的作用。Ca2+通过T淋巴细胞膜上的Ca2+通道(Ca2+release activated Ca2+channel,CRAC)进入细胞内,可作为第二信使激活T淋巴细胞。K+通过K通道外流形成T细胞膜电位,再通过膜电位水平调节Ca2+通道(CRAC)进而影响Ca2+的内流,而Ca2+可作为第二信使激活T淋巴细胞。目前,有关T细胞K+、Ca2+通道与乙型重型肝炎免疫损伤之间的研究尚未见报道。基于上述背景,本实验以乙型重型肝炎肝移患者的病肝组织为研究样本。首先,针对以往研究多局限于动物模型或外周血的情况,我们分析了乙型重型肝炎肝内CD4、CD8及病毒特异性T细胞的分布特点,找出与肝脏损伤的最为相关的CD8+T细胞为研究靶细胞;其次,针对T细胞离子通道与肝脏免疫损伤关系的研究是一个空白的情况,我们选择在T细胞上表达的K+、Ca2+通道,从基因水平、蛋白水平及电生理角度比较CD8+T细胞离子通道的特征;最后,通过药物干预进一步探讨K+、Ca2+通道与CD8+T细胞增殖、激活和杀伤功能之间的关系。主要研究结果:1.至2007年10月31日,共收集急性乙型重型肝炎样本5例、慢性乙型重型肝炎样本24例、慢性乙型肝炎样本31例以及正常样本17例。所有样本均为新鲜肝脏组织,取部分肝组织4%多聚甲醛固定进行组织学研究,剩余样本立即进行酶消化后提取总的淋巴细胞并置于液氮中冻存。2.免疫组织化学及流式细胞定量分析结果均表明,乙型重型肝炎患者肝内CD8+T细胞大量增加,而CD4+T细胞及病毒特异性CTL与CHB患者比较无显著差异。为了明确上述免疫细胞与肝脏损伤的关系,实验结合肝功能指标进行了相关分析,发现乙型重型肝炎患者肝内CD8+T细胞均与血清ALT水平呈显著正相关(r=0.563,P=0.021);病毒特异性CTL与肝功能指标无明显相关性(P >0.05)。3.乙型重型肝炎组CD8+T淋巴细胞钙激活钾离子通道(KCa)表达上调。定量PCR与Western-Blot结果表明乙型重型肝炎组KCNN4/KCa3.1通道在mRNA及蛋白水平均较慢性乙型肝炎组和正常对照组均明显增加(P<0.05)。全细胞膜片钳记录结果表明乙型重型肝炎组和慢性乙型肝炎组CD8+T细胞KCNN4/KCa3.1通道外向型钾电流则较正常对照组明显增加,且乙型重型肝炎组钙激活钾通道电流的增加幅度较慢性乙型肝炎组更加明显(P<0.05)。4.扫描激光共聚焦分析表明,乙型重型肝炎组CD8+T淋巴细胞内Ca2+浓度增加,出现钙超载的现象。全细胞膜片钳记录结果表明乙型重型肝炎组和慢性乙型肝炎组CD8+T细胞CRAC通道内向型钙电流则较正常对照组明显增加,且乙型重型肝炎组钙激活钙通道电流的增加幅度较慢性乙型肝炎组更加明显(P<0.05)。5. MTT细胞增值试验和杀伤试验表明,乙型重型肝炎组CD8+T细胞增值程度和杀伤能力比慢性乙型肝炎组明显增加。药物干预试验发现,对细胞增殖、杀伤功能影响程度大小依次是CRAC阻断剂>KCa通道阻断剂>Kv通道阻断剂,提示钙离子通道对CD8+T细胞的功能影响更大。综合上述一系列的实验结果,我们可以初步得出结论,即乙型重型肝炎患者肝内CD8+T细胞的活性和非特异性杀伤功能较正常组增强,其中CRAC钙离子通道及KCNN4/KCa3.1钾离子通道表达增强可能是导致CD8+T细胞增殖、活化和杀伤功能增强的的重要原因之一。主要创新点:1.以肝组织为研究样本,避免了上述研究多局限于外周血及动物模型的情况,使研究结果更能真实地反应乙型重型肝炎发病时的肝脏免疫状态。2.观察到了乙型重型肝炎肝内CD8+T细胞KCa3.1及CRAC离子通道出现异常表达,且这些通道可能是导致CD8+T细胞增殖、分泌及杀伤功能异常增高的重要原因之一。3.从T淋巴细胞离子通的角度为乙型重型肝炎的免疫发病机制研究提供一条新思路和新途径。