在细胞中,膜内蛋白酶作为一种特殊的生命调节体在多种生命活动中起着关键的作用,包括线粒体动力学、细胞凋零的调节以及寄生虫入侵等生物过程。膜内蛋白酶催化机制的研究发展可以为一些疾病的治疗提供新的方案,例如阿兹海默症、帕金森疾病、癌症以及疟疾等疾病。最近,斜切蛋白酶及其底物（TatA）的复合物晶体结构的发现促进了斜切蛋白酶的催化机制的研究发展。斜切蛋白酶是由六个跨膜螺旋以及四个柔性环组成的。两个催化残基（Ser201和His254）分别位于Tm4和Tm6上,其中催化残基Ser201距离脂质膜表面大约10?。根据底物蛋白在斜切蛋白酶中的位置,底物可以与来自Loop5的残基Ser248和Ala250以及来自Loop3的残基Gly198和Trp196等形成氢键相互作用,这些相互作用可以稳定底物结构。然而,有一个关键的问题应该进行探讨:底物是如何进入斜切蛋白酶活性位点的?但目前的研究并没有给出明确的答案。因此这也成为本论文主要的研究内容。在这篇文章中,斜切蛋白酶单体和复合物的结构被分别嵌入到双层脂质膜（POPE）中并且各自进行了300 ns分子动力学模拟。经过分析,两条可能的底物进入活性位点的路径已经获得:一条路径朝向蛋白侧面,处于Tm2和Tm5之间,具体方向为Ala5的Cα原子和Gly7的Cα原子间的方向向量;另一条路径朝向蛋白上方,处于Loop3和Loop5之间,具体方向是Thr3的Cα原子与Ile1的Cα原子间的方向向量。当底物沿着相同的路径进入活性位点时,其过程产生的中间构象变化与底物排出过程中是相似的。因此,利用拉伸分子动力学,分别模拟了底物沿着两个方向的排出蛋白的过程。基于上一步的结果,通过伞形取样分别得到底物沿着两个方向排出的平均力势能量曲线。当底物沿着路径1向蛋白外排出时,所需要克服的能量为34.71 kcal·mol^-1;当底物由路径2排出时,所需要克服的能量为34.44 kcal·mol^-1。对比底物沿着两条路径排出所需的能量值,我们很难判断出哪条路径是更加可行的。根据报道,脂质分子的包围会减慢斜切蛋白酶的水解速率,从一定程度来说,会阻碍了斜切蛋白酶中门域的打开。由于路径2朝向蛋白上方,这个方向有着更加稀薄的脂质分子,所以底物可能倾向于沿着路径2进入。当底物沿着路径2排出活性位点时,Tm2,Loop3,Loop5和Tm5的构象变化有利于底物的排出（进入）。除此以外,His150作为一个重要的残基不仅能与底物形成稳定的相互作用来帮助底物结合,而且能够使底物发生形变并使之更加适应通道结构。这些重要的结论能够促进斜切蛋白酶选择性抑制剂的设计与合成以及斜切蛋白酶催化机制的发展。