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背景甲状腺癌（TC）占全世界所有癌症诊断的约2.1%,其中约77%的诊断发生在女性中。仅在2012年全世界就有大约二十三万名女性和七万名男性新患有甲状腺癌,女性的年发病率为6.1/10万,而男性年发病率为2.0/10万;致死率相当于约0.6/10万名女性和0.3/10万名男性。甲状腺癌是世界范围内的主要公共卫生问题,因为有着很高的发病率,给整个人类的生活都带来了很大的不便。现在可通过手术切除、放射性碘治疗和药物靶向等方法治疗TC,但它通常不能治愈,因此寻找更方便有效的药物是治疗人甲状腺癌的巨大挑战。EGCG（Epigallocatechin gallate）即表没食子儿茶素没食子酸酯,是绿茶儿茶素的主要成分,约占总儿茶素的59%,它对细菌、病毒、凝血酶、炎症以及肿瘤等都有适当抑制作用。EGCG抑制癌症的特性长期以来是科研的重点,目前有研究显示其对胃癌、直肠癌、肝癌、白血病、胰腺癌等恶性癌症都有显著的抑制作用,然而对甲状腺癌的抑癌作用却很少研究。因此,本课题以人甲状腺癌细胞来研究EGCG的抗癌作用,以期望在饮茶过程中降低甲状腺癌发病率。目的研究EGCG对人甲状腺癌细胞的抑制作用及其作用机制。方法1体外细胞实验1.1 MTT细胞活力实验和EdU细胞增殖实验MTT会通过活细胞中琥珀酸脱氢酶反应生成难溶于水的蓝紫色化合物并存储在线粒体中。而二甲基亚砜可将化合物溶解,并且在特定范围内,溶液的颜色深度与化合物量成比例,用酶标仪检测OD 490 nm也与化合物含量成比例。故它通常用来测定活细胞数量和检验细胞活力。EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）是胸腺嘧啶核苷类似物,当DNA复制时,EdU可以交换胸腺嘧啶（T）渗入到新的DNA链中,通过一个“Click”反应,再通过EdU与Apollo荧光染料的特异性荧光反应新合成DNA量,进而通过检测荧光来分析细胞的增殖速率。1.2一步法TUNEL细胞凋亡检测细胞处在凋亡时,特定DNA内切酶可使细胞DNA链发生断裂,从而形成许多暴露的3’-OH端,在TdT的存在下脱氧核糖核苷酸被加上荧光素（FITC）标记的dUTP,从而用来检测细胞的凋亡。而对照或者存活的细胞不太可能产生3’-OH,没有标记dUTP,也不能通过TUNEL试剂所染色。观察和分析EGCG处理后细胞凋亡率。1.3细胞划痕实验细胞划痕法是检测癌细胞伤口修复特征的相对简单的实验方案,通过在生长的单层细胞上人为的划线使培养皿底部被划部分的细胞脱落而呈现的一道“沟痕”,之后再培养细胞来模拟体外细胞致伤愈合实验,进而衡量药物对癌细胞运动和修复的影响。当细胞培养至对数生长期后,加入等量EGCG终浓度为10?M,25?M,50?M,100?M,200?M的无血清完全培养基,在0 h进行划痕拍照记录,分别于12和24 h用显微镜观察伤口愈合的状态,分析讨论伤愈率。1.4细胞迁移和侵袭实验在实验中所用迁移（Transwell）小室底部膜上有8?m小孔,在小室内部铺入癌细胞,用结晶紫来检测细胞穿过小孔而进入下室来模拟癌细胞进入血管的过程;而细胞侵袭（Invasion）小室底层膜上有一层基质胶用于模仿癌细胞侵袭过程。在24孔板底部,添加600-800μl血清浓度为20%的细胞培养基,并向上室中添加等量200μl细胞悬浮液,同时加入EGCG溶液,使EGCG的终浓度为0,10,25,50,100,200?M,置于37℃,5%CO2恒温培养箱继续生长24 h后通过结晶紫染色统计细胞迁移和侵袭的数量。1.5细胞周期检测实验DNA合成是细胞周期中必要的过程:G1期细胞具有一个基因组拷贝,S期细胞积极参与DNA合成,G2期细胞核的DNA量是G1期的两倍,可以通过用荧光染料染色然后进行流式细胞仪量化来检测核中DNA量。1.6 Western blot蛋白免疫印迹法是常用的测定蛋白表达量的途径,目前Bcl-2/Bax,Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP是细胞程序性死亡过程中机制研究的主要目标蛋白,以及EGCG抗癌机制中EGFR-RAS-RAF-MEK-ERK的蛋白相对表达量。2体内动物实验2.1构建肿瘤模型和给药消化和收集对数生长期人甲状腺细胞TT\TPC-1\ARO,用无菌生理盐水进行重悬细胞,使细胞浓度为5×106个/200μl,用一次性无菌注射器于动物右前肢腋下通过皮下接种细胞悬液200μl。移植瘤成模后,按照给药组每组每只每天瘤旁皮下注射EGCG浓度为10,25,50,100,200?M的无菌生理盐水溶液或者PBS缓冲液200μl,Control组每只注射200μl无菌溶剂。给药周期四周（28天）。2.2 HE染色和免疫组化HE染色可用来观察检测健康组织切片和病理切片的形态结构,是最基本的病理学检测途径。免疫组织化学是基于抗原与抗体特异性反应的理论,利用显色反应来分析组织和细胞内蛋白,然后来定性和定量的讨论分析病理现象。结果1.MTT和EdU实验结果显示:与Control组相比,随着EGCG处理浓度的升高,人甲状腺癌细胞的细胞活力和增殖率越来越低（p<0.05）,且细胞活力和增殖率降低程度呈现剂量依赖性。2.一步法TUNEL细胞凋亡实验结果显示:与Control组相比,随着EGCG处理浓度的升高,人甲状腺癌细胞的凋亡率越来越高（p<0.05）且呈现剂量依赖性。3.细胞划痕、迁移和侵袭实验结果显示:与Control组比较,当EGCG给药浓度的升高时,细胞划痕伤口愈合率、迁移和侵袭细胞总数逐渐下降（p<0.05）并具有剂量依赖性。4.细胞周期检测实验结果显示:与Control组相比,随着EGCG处理浓度的升高,S期细胞DNA含量越来越高（p<0.05）相反G2期显著降低（p<0.05）,即阻滞细胞周期中的G1/S期。5.HE染色实验结果显示:同Control组相比,EGCG处理组HE染色较浅,且细胞排列疏松,细胞间隙大,且在给药浓度100-200?M时明显可见组织空缺和细胞凋亡区域。6.免疫组化结果显示:同Control组比较,随着EGCG给药浓度的升高,Ki67染色区域降低,染色变浅,Ki67阳性细胞数减少,表明EGCG显著降低了人甲状腺癌细胞在实验动物皮下的生长（p<0.05）;微血管密度降低,且给药浓度越高,微血管数量越少（p<0.05）;Cleaved-PARP的阳性细胞率升高,且EGCG浓度越高,组织细胞凋亡越强（p<0.05）。7.Western blot结果显示:与Control组相比,凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP相对表达逐渐增加且随着EGCG浓度的升高逐渐升高（p<0.05）;作用机制通路WB结果显示:与Control组相比,p-EGFR、Ras、p-RAF、p-MEK、p-Erk1/2蛋白表达逐渐降低且随着EGCG浓度的升高逐渐降低（p<0.05）。结论1.EGCG能显著降低人甲状腺癌细胞的增殖、存活、迁移、侵袭和阻滞细胞周期进程。2.EGCG能明显克制异体移植瘤的生长,促进癌细胞在体内的死亡,降低了CD-31标记的微血管在甲状腺肿瘤中浸润程度。3.在作用机制上,EGCG可能通过抑制EGFR的磷酸化修饰来抑制Ras、p-RAF、p-ErK、p-MEK的磷酸化修饰,进而发挥抗人甲状腺癌的作用。4.EGCG对人甲状腺癌的抑癌作用呈剂量依赖性,即随着EGCG给药浓度的升高抗癌作用增强。