两栖类皮肤裸露、缺乏角质层且通透性高,通过抗菌肽抵抗环境中致病微生物的侵袭。大量研究已经揭示在致病微生物的胁迫下两栖类合成和分泌抗菌肽的过程和机制。然而,两栖类所处的正常环境中,常在微生物通常没有致病力,这些微生物是是否对抗菌肽的合成具有影响作用,如果有,影响机制是什么?回答这些问题对理解生理适应性和抗菌肽的进化机制具有重要意义。为了回答这两个问题,本研究选择黑斑侧褶蛙(Pelophylax nigromaculata)为对象,通过高通量测序获得黑斑侧褶蛙的主要生境水体中的微生物群落概貌和其野外状态下的皮肤组织的完整转录本。首先利用注射去甲肾上腺素促使蛙体排空绝大部分颗粒腺中贮存的抗菌肽,而后置于不同微生物丰度的水体中,通过组织学观察不同微生物丰度的环境中皮肤颗粒腺恢复过程;采用高通量测序获得不同组别的全转录组,分析差异表达的基因,并对 TLR2、TLR4、TLR5、NOD1、NOD2、TAK1、NF-κB1、IκBα、pelophylaxin-HB1、ranacyclin、brevinin、pleurain-E 和 temporin-1 等基因的表达量进行定量检测,揭示环境微生物丰度与皮肤组织中各个信号分子和抗菌肽mRNA的表达变化情况。主要研究结果如下:1、在组织学和分子水平上,环境中的所有微生物均为两栖类的抗原,共同调控两栖类的免疫应答和水平。2、在微生物丰度高的环境中,蛙体免疫需求大,抗菌肽的合成速度加快,分泌多,且蛙皮颗粒腺大,充盈度低;而微生物丰度低的环境,蛙体免疫需求小,抗菌肽的合成速度缓慢,分泌少,且蛙皮颗粒腺小,充盈度高。3、微生物的刺激可通过TLR4识别并接收抗原信号,然后通过NF-κB1与IκBα进行信号传导,从而调节抗菌肽的合成。这些结果说明,环境中所有微生物均为抗菌肽合成的刺激源,也是抗菌肽免疫代价的主要因素。