由病原真菌Magnaporthegrisea(Hebert)Barr(无性态：PyriculariagriseaSacc.)引起的稻瘟病是全球水稻生产上最具毁灭性的病害之一。该病害的大范围发生不仅影响生态系统的功能而且造成当地的经济损失。实践证明，培育和合理利用抗病品种是控制这一病害最经济有效和对环境最安全的手段。然而，具有单一抗病基因的水稻品种在广泛种植了一段时间以后往往就丧失了抗病性，将同一病害的不同抗病基因聚合到同一品种中，被认为是获得高水平持久抗病性的重要途径之一。分子标记辅助选择是抗病育种中实现基因聚合快速而有效的途径。另一方面，抗病基因是植物-病原物互作中的一个关键因子，克隆抗病基因是揭示植物-病原物互作机理和了解寄主与病原菌共进化规律的基础。因此，对抗病基因进行定位，寻找与之连锁的分子标记和克隆抗病基因就变得非常重要。水稻稻瘟病抗病基因Pikp对来自日本和中国的许多稻瘟病菌生理小种具有稳定的抗病性，为了更好地利用该基因，本研究致力于对Pikp基因的定位和克隆，得到如下结果： 1.Pikp的遗传及物理作图 通过构建包含目的基因Pikp的F2代作图群体，利用混合群体分离分析(bulked-segregantanalysis，BSA)和隐性群体分析(recessiveclassanalysis，RCA)相结合的方法，利用第11染色体长臂上公开发表的基于PCR技术的8个微卫星(simplesequencerepeats，SSR)标记，以及自主开发的1个扩增片段酶切多态性序列(cleavedamplifiedpolymorphicsequences，CAPS)标记进行了连锁分析。结果获得了2个候选连锁标记(RM5926、K37)。利用这2个标记对2个组合共681个F2个体进行了连锁分析，结果表明，这2个标记与目的基因连锁，遗传距离分别为3.08和0.29cM，并且位于目的基因的两侧。为了进一步缩小目的基因区域，利用9个Pikm基因的连锁标记(李落叶，2005)进行了连锁分析。结果表明，K34和K37位于Pikp基因的同一侧，另5个标记(RM144、K15-2、K25、K22、K28)与RM5926一起位于Pikp基因靠近端粒的一侧；而K33则与Pikp基因共分离；由此将该基因位点界定于标记K34与K28之间0.74cM区域。为了进一步缩小目的基因区域，利用测序品种日本晴的参考序列，通过生物信息学分析法(bioinformaticsanalysis，BIA)，在目的基因区域开发了新的SSR和序列标签位点(sequencetaggedsite，STS)标记。在开发的4个标记K39、K40、K41和K42中，K39在来自K34的重组体中检测到1个重组事件，与目的基因的遗传距离为0.14cM；另外3个标记K40、K41和K42则与目的基因Pikp完全共分离。综合上述连锁分析的结果，Pikp位点被界定在侧翼标记K39和K28之间的0.66cM区域，4个分子标记K33、K40、K41和K42则与之完全共分离。 为了构建该位点的物理图谱，将与Pikp紧密连锁的标记分别着陆到日本晴的细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome，BAC)和P1介导的人工染色体(P1-derivedartificialchromosome，PAC)克隆上，根据连锁标记的物理位置构建了基于日本晴参考序列的Pikp位点的电子物理图谱。结果表明，Pikp位点被定位在大约142kb的物理区域内。 2.Pikp候选基因的鉴定 利用2种生物信息学软件RiceGAAS(Autopredgeneset，http：//ricegaas.dna.affrc.gojp)系统和SoftBerry(http：//www.softberry.com)对目的基因区域进行基因预测，初步确定了Pikp的候选抗病基因为KP1、KP2、KP3和KP4。为了确定基因预测结果，利用RT-PCR技术对4个候选基因进行了表达模式的分析。结果表明，候选基因KP2和KP3表现为组成型表达；而KP1和KP4则不表达，从而排除它们作为候选基因的可能性。因此，将KP2和KP3作为该目的基因的候选基因。 3.候选基因的遗传互补分析 为了验证上述2个候选基因的功能，利用长片段PCR(long-rangePCR，LR-PCR)技术以及双元载体转化体系pCAMBIA1300AscI，对2个候选基因进行扩增及克隆。然后，以高度感病品种Q1063作为受体，通过农杆菌介导法进行了候选基因克隆的遗传转化。其中候选基因KP2已获得一些转化苗，并对其T0代的转化苗进行了初步的表型鉴定。结果表明，KP2不是Pikp的功能基因。由于KP3的克隆获得较晚，相关的遗传转化尚在进行中。