一、研究背景截止到2013年,柳叶刀杂志指出：全球范围内,食管癌在癌症致死的病因中占居第六位,影响了超过450000的人口,此数据还在不断地增加。其总五年生存率约15%-25%,难以早期发现和诊出食管癌,以及它极强的肿瘤远处转移倾向都是造成五年生存率低下的原因。食管癌在全球分布存在所谓的“亚洲带”,即亚裔人群中,包括伊朗、哈萨克斯坦、中国北部和中部,都是食管鳞癌的高发地区,每年100000人口中就100例的食管鳞癌发病率。食管癌的治疗包括外科治疗、放射治疗、化学治疗和综合治疗。而多数中晚期病人已经失去了手术机会,只能采用放疗化疗结合的方式,而晚期化疗效果并不理想。而对于早期患者,常规治疗可使其获得超过90%的五年生存率。探索新的食管癌抑癌基因,对其机制进行深入分析可能为食管癌的早期诊断与治疗提供靶标。目前,鳞状细胞癌(SCC)是全世界中晚期食管癌的主要组织学类型。但在澳洲、英国、美国和某些欧洲国家,其腺癌发病率已超过鳞癌。与其他肿瘤类似,食管鳞癌的发生也是由诸多步骤逐渐促发的多级过程。其中就包括了原癌基因的激活以及抑癌基因的失活。抑癌基因是指一大类可抑制细胞生长,并且具有潜在抑制癌变作用的基因。它具有三大特征：①在某种肿瘤的相应正常组织中可正常表达；②在该肿瘤中此基因应该发生某些改变,如点突变、DNA片段或全基因的缺失或表达缺陷；③导入该种基因后,使其表达上调,原本该基因表达缺陷的恶性肿瘤细胞的部分或全部相关肿瘤表型将受到抑制。抑癌基因在调控细胞周期、血管生成、信号转导甚至化疗药物耐药的发生中都发挥着重要作用。它通过正常细胞与肿瘤细胞的融合,抑制癌变细胞的细胞表型,另外还可导致细胞的杂合性缺失。其失活是基因与表观遗传学层面共同起作用的结果。基因表达缺失和点突变直接影响抑癌基因发挥功能,而包括启动子CpG岛区域的甲基化在内,以及组蛋白发生甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化等修饰过程的表观遗传学机制也常常是使得抑癌基因功能缺失,成为肿瘤发生并进展的关键因素。DNA的甲基化的本质是一种简单的共价化学修饰,它是以S-腺苷蛋氨酸作为甲基供体,由DNA甲基化转移酶催化,将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的反应。当甲基原子团连接在基因的DNA上时,基因转录终止,基因发生沉默。在哺乳动物基因组中,DNA甲基化的主要位点是CpG二核苷酸,它在基因组中呈不均匀分布。但是,在某些区域,CpG寡核苷酸是呈集中分布的,这些区域的CpG序列密度比平均密度高10～20倍,G+C含量大于50%,其长度大于200个碱基,这些区域被命名为CpG岛。CpG岛对基因的表达起着调控作用,具有特殊的意义。CpG岛的甲基化导致抑癌基因失活是肿瘤发生与进展中的主要表观学改变。肿瘤中,低甲基化通常发生在DNA重复序列上,甲基化则主要牵涉到CpG岛。CPG岛通常位于基因启动子区,也可延伸至外显子,大小从500bp到5000bp不等。DNA甲基化是一种表观遗传修饰,CpG二核苷酸是哺乳动物基因组中DNA甲基化的主要位点。它在基因组中的分布是不均匀的,大约50%的人类基因中含有CpG岛,常位于基因上游调控区的启动子区域,这些基因被称为管家基因或组织特异表达基因。肿瘤中常常发生多种基因的异常甲基化,抑癌基因包括在内,此外,DNA损伤修复的相关基因及肿瘤代谢和浸润相关基因也常发生异常甲基化。而且,肿瘤抑制因子或具有肿瘤抑制功能的所发生的DNA甲基化比肿瘤细胞的突变发生率更高。CpG岛的异常甲基化将导致基因沉默,使抑癌基因失活。接着,抑癌基因又可以通过阻断许多正常的细胞通路,如凋亡或细胞周期等,造成肿瘤加速生长。在肿瘤细胞中有成百上千个基因发生甲基化,而突变基因则只有几十个。通过DNA甲基化导致基因失活并促进癌变的表观遗传沉默,表明DNA甲基化能够明确影响正常细胞走向癌变的进程。总的说来,肿瘤组织中有两种DNA异常甲基化的情况,包括广泛低甲基化和局部高甲基化。前者可使原癌基因活化,形成突变热点,增加染色体的不稳定性,使转座子异常表达；后者则直接或间接影响基因转录,也可导致胞嘧啶-胸腺嘧啶突变。目前对于基因的DNA甲基化造成抑癌基因失活从而如何影响肿瘤癌变进程正成为新的研究热点。EPB41L3又名4.1B、Dal-1,是一种属于4.1家族的重要膜骨架蛋白,在人类多种组织器官中广泛表达。与此相对的是,越来越多的研究发现EPB41L3在多种肿瘤中呈现异常表达。如在食管鳞癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胶质瘤、脑膜瘤、肾透明细胞癌等多种肿瘤组织中,EPB41L3的表达均较正常组织发生下调。Yajie Zhang等发现在超过71.4%的非小细胞肺癌细胞和临床组织中下调；Kittiniyom Kearly等报道在乳腺癌肿瘤组织中也出现其表达缺少,且大约三分之二的导管原位癌和侵袭性导管癌中都出现了这一情况：Bernkopf等研究得出EPB41L3在前列腺癌中表达缺失的结论,并提示若上调其表达可有助于治疗前列腺癌；Daisuke Yamada等在肾透明细胞癌中发现EPB41L3常发生甲基化,它的检出,可能成为手术切除后复发转移的独立的预后预测指标。总的说来,目前已有的报道证明了EPB41L3可能在多种肿瘤中发挥抑癌基因的作用,它的甲基化与肿瘤发生和预后较差相关。然而,目前在食管癌中还没有类似研究的报道。揭示EPB41L3在食管癌中是否因为甲基化而无法发挥抑癌基因的作用,并对肿瘤癌变过程起到哪些影响,当中又牵涉到哪些分子生物机制是我们关心的问题。我们的既往研究发现肿瘤组织中的基因EPB41L3甲基化率明显高于相应的正常组织。食管癌组织中的甲基化率为59.5%,临近正常组织中则为4.8%,P值为0.000。EPB41L3的启动子区域有13个CpG位点发生甲基化,食管癌组织比正常组织中EPB41L3表达下调超过10倍。而且甲基化率与肿瘤大小相关,大的食管癌肿瘤组织中的甲基化率比小的肿瘤组织中要高。深入分析患者的病理资料后,发现有77.8%的pT3样本发生了EPB41L3的甲基化,而pTl-pT2样本中则为26.7%。这提示我们EPB41L3可能因为甲基化在肿瘤中发生沉默,并在肿瘤发生进展中起到关键作用。虽然上述提到的研究结论可将EPB41L3与食管鳞癌的发生与进展联系在一起,但EPB41L3在食管鳞癌细胞中的具体表达状况以及是否发挥抑癌作用和相应的机制尚不明确,还需要进一步深入研究。本课题旨在探究EPB41L3在食管鳞癌中发生甲基化和抑制肿瘤发生发展的作用及其机制。鉴于局部进展和远处转移是食管鳞癌病人的主要死因。进行外科手术和放化疗治疗后,食管鳞癌病人的五年生存率仍然低下。如何早期检出食管鳞癌患者,如何提高治疗疗效,如何开发新的有效的分子靶向药物是医学界面临的难题。有研究表明未来可能有多种分子标记物用于进行食管鳞癌病人的早期检测、预后评价、新药研发。这无疑是个令人振奋的消息,因为我们也侧重研究了病人的病理资料与EPB41L3表达之间的关系,这为今后EPB41L3在临床的应用,打下了坚实研究基础。二、研究方法1细胞培养与处理Hetla、TE1、KYSE150、KYSE450、KYSE510细胞使用RPMI-1640,Eca109、 Caes17细胞使用高糖DMEM,均分别添加10%胎牛血清,将细胞培养箱的温度设置为37℃、CO2为5%的浓度,相对湿度为50%,之后根据细胞的生长速度更换培养基,一般为1-2天,用含有0.25%胰蛋白酶以及0.02%EDTA的胰酶工作液消化并使细胞分散,进行传代或接种培养。2侵袭试验将细胞培养至良好状态,传代至24或12孔培养板,按常规细胞培养流程过夜培养,待细胞生长到处于对数生长期,细胞融合密度达80%左右时,采用invitrogen公司的转染试剂Lipofectamine 2000进行转染,具体操作参考说明书,转染达到48小时后,分别进行提取细胞的总蛋白以及迁移和侵袭的检测。迁移试验时,用无血清培养基将1.0×105细胞重悬接种于BD小室内；侵袭试验时用无血清培养基将2.0×105细胞重悬接种于Matrigel包被的BD小室内。37℃培养箱中,培养24h后取出小室,用PBS轻轻漂洗,用95%甲醇室温固定20min；甲醛配制的0.25%结晶紫予以染色,室温染色30min,清水漂净,用棉签擦去上室内细胞；镜下拍照计数。3划痕实验先用马克笔在6孔板背后,用直尺作为直线标准,均匀的画出横线,大约每隔0.5～1cm一道,横穿过孔。每孔至少穿过5条线。接着在各孔中加入约5×105个细胞,第二天用枪头比着直尺,尽量垂至于背后的横线划痕,枪头要垂直,不能倾斜(不同孔之间使用不同枪头)。PBS洗细胞3次,洗掉划下的细胞,加入无血清培养基。最后放入37℃ 5% CO2培养箱培养。可按0,24h,48h时间点取样并拍照。4免疫印迹试验冰上裂解细胞提取总蛋白；SDS-PAGE电泳分离蛋白并转移PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭1小时；4℃下,将一抗孵育过夜；常温时,将二抗孵育1小时；使用化学发光法,CCD曝光,扫描。5普通PCR采用Omega公司Omega Total RNA Kit I (Omega, GA, USA)提取食管鳞癌细胞总RNA；分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度和纯度,并进行质量控制检测；采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with a gDNA Eraser (Takara Bio Inc, Japan)进行逆转录；将逆转录完的cDNA与其他试剂混合,配置PCR反应液,并放入热循环仪,按相应PCR反应条件进行加热；最后将加热产物进行琼脂糖凝胶电泳。6荧光定量PCR应用Omega公司Omega Total RNA Kit I (Omega, GA, USA)提取食管鳞癌细胞总RNA;采用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度和纯度,从而得以进行质量控制检测；采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with a gDNA Eraser (Takara Bio Inc, Japan)进行逆转录,之后用SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio Inc, Japan)进行实时定量,GAPDH作为本实验的内参。具体实验流程参照相关各试剂盒说明。7 CCK8使用日本同仁公司的CCK8试剂盒检测细胞增殖情况,具体实验流程参照试剂盒说明。8流式细胞学检测周期与凋亡使用中国凯基公司的试剂盒分别检测细胞周期与凋亡状态。具体实验流程参照试剂盒说明。9免疫组化常规脱蜡水合；加热；冷却至室温；3%H202室温处理10min；山羊血清室温封闭；一抗4℃过夜;二抗室温孵育；DAB显色；苏木素复染；1%盐酸酒精分化；水洗反蓝；晾干封片。10甲基化修饰与甲基化PCR使用美国Omega公司的Tissue DNA Kit提取七种细胞DNA,分光光度计DNA的浓度,应用Epigentek公司的BisulFlash DNA Modification Kit进行甲基化修饰,采用中国Takara公司的TaKaRa Taq Hot Start Version配液并处理,进行琼脂糖凝胶电泳检测EPB41L3在各细胞中的甲基化状态。具体实验流程参照相应试剂盒说明。11焦磷酸测序提取、修饰并纯化七种细胞的DNA,进行甲基化PCR,之后在美国QIAGEN公司的Pyrosequencing检测仪上进行反应,并用Pyro Q—CpG软件自动分析每个位点甲基化状态。12明胶酶谱使用中国莱德尔公司的试剂盒MMP Zymography Assay Kit检测细胞中mmp2与mmp9的活性。具体实验流程参照相应试剂盒说明。13裸鼠成瘤采用购自南方医科大学4-5周龄的雄性裸鼠,四只为一组,分别在背部皮下接种稳定过表达慢病毒的KYSE150或干扰EPB41L3的shRNA的KYSE450食管鳞癌细胞悬液,每周测一次肿瘤体积,计算公式为1/2*长径*短径2。14统计学处理两组之间的差异比较使用独立样本t检验(Independent-samples t test),三组以上比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。 EPB41L3之间的关系和食管鳞状细胞癌的临床病理特征应用χ2检验。生存曲线使用Kaplan Meier方法和log-rank进行分析。单变量和多变量分析使用Cox比例风险回归模型。统计学意义设定在p<0.05时。所有实验重复至少三次。所有数据被用平均值±标准差(mean±SD)表示。使用SPSS 13.0版软件进行统计分析。三、研究结果1 EPB41L3在食管鳞癌组织和细胞中低表达,且在食管鳞癌细胞中发挥抑癌作用(1) EPB41L3在食管鳞癌组织和细胞中的表达低于食管癌旁组织与食管上皮细胞,并与肿瘤浸润深度、TNM分期以及生存期呈相关。为了检测EPB41L3在食管癌中的表达,我们先在组织层面上予以检测：采用97例石蜡包埋的食管鳞癌及癌旁正常食管上皮组织的组织芯片进行免疫组化,发现在91例食管鳞癌旁组织的细胞膜和细胞质中,EPB41L3呈高表达,6例为低表达或不表达；而在72例食管癌组织中,EPB41L3为低表达或不表达,20例为高表达。接着在细胞层面上予以检测：我们发现在六株食管鳞癌细胞中,EPB41L3的表达均低于正常食管上皮细胞。接着我们对组织芯片的病理及生存期资料进行分析,发现EPB41L3的表达水平与食管鳞癌患者的年龄、性别、肿瘤病理类型或淋巴结是否阳性无关,而与肿瘤浸润深度和TNM分期呈相关(P=0.016)。而且,与患者的生存期也是正相关(P=0.002)。(2)EPB41L3在食管鳞癌细胞中发挥抑癌功能我们的实验从增殖、凋亡、迁移侵袭和细胞周期四个方面阐述EPB41L3对食管鳞癌的抑癌功能。首先我们通过转染使得EPB41L3在食管鳞癌细胞KYSE150, KYSE510和KYSE450过表达后,进行CCK8和克隆形成实验,结果证实转染后的食管鳞癌细胞增长与克隆形成能力明显受到抑制。之后的体外实验中,通过小鼠皮下荷瘤,支持了之前体内增殖实验的结果。接着我们又用流式细胞学检测的方法进行凋亡相关研究。结果发现EEPB41L3过表达组的凋亡率明显高于对照组。为了检测细胞迁移侵袭功能,我们进行了划痕与Transwell实验。证实了EPB41L3可抑制食管鳞癌细胞的迁移与侵袭。最后,我们还用流式细胞学检测的方法,发现EPB41L3可引起G2/M阻滞。2 EPB41L3在食管鳞癌组织和细胞中低表达并发挥抑癌功能的机制(1)EPB41L3在食管鳞癌细胞中发生甲基化而表达下调对于正常食管上皮细胞Het-1a和六株食管鳞癌细胞(Eca109, Tel, KYSE150, KYSE450, KYSE510),我们进行甲基化PCR,这是是否发生甲基化的定性实验,结果EPB41L3在正常食管细胞Het-1a中未发生甲基化,而在食管鳞癌细胞中均发生了部分甲基化。接着我们进行焦磷酸测序这一定量研究。检测CpG岛上位于-141551,-141494,-141439,-141379 bp处的33个位点的甲基化状态,结果EPB41L3在六株食管鳞癌细胞系中的五株里显示为高甲基化,而在食管正常细胞中为非甲基化。而之后用去甲基化药物5-Aza-2-deoxygcitidine(5-氮杂-2’-脱氧胞苷)处理食管鳞癌细胞再行PCR, RT-PCR和免疫印迹来检测1PB41L3的表达情况时,结果显示EPB41L3在食管鳞癌恢复表达。上述实验综合说明了EPB41L3的确在食管鳞癌中发生甲基化。(2) Epb4113通过PI3K/MAPK, Caspase3/8/9和Cdc2/Cyclin B1通路调节发挥抑癌作用为了深入探讨EPB41L3在食管鳞癌中发挥抑癌作用的机制,我们进行了一系列免疫印迹实验。在食管鳞癌细胞中将EPB41L3经转染处理过表达之后,我们发现在经典的增殖相关的MAPK通路中两个重要节点,P-erk与P-p38的表达上调,P-JNK无明显变化；接着在凋亡通路Caspase中,caspase8, caspase9和caspase3的表达均发生上调；我们还检测了五个周期蛋白的表达,发现Cdc2(cdkl)和Cyclin B1的表达受抑制,CyclinA, CyclinD和CyclinE的表达未发生变化；最后我们检测了MMP2与MMP9的表达,结果其表达受到抑制。上述实验得出结论：Epb4113通过PI3K/MAPK, Caspase3/8/9和Cdc2/Cyclin B1通路调节发挥抑癌作用。四、结论本研究中,我们首次揭示了EPB41L3在食管鳞癌中发生甲基化并起到抑癌作用及其机制。我们发现在食管鳞癌组织中EPB41L3表达降低,且在食管鳞癌中的表达量低于临近正常组织。在食管鳞癌细胞中,EPB41L3因发生甲基化而表达下调,进而抑制食管鳞癌细胞的增殖和侵袭,诱导凋亡和G2/M阻滞的发生。进一步的机制分析还证明了MAPK, Caspase3/8/9, Cdc2/Cyclin B1通路参与了EPB41L3对食管鳞癌的抑癌功能。此外,通过食管鳞癌组织芯片中病理参数与预后的分析还发现,EPB41L3的表达高低与肿瘤浸润深度、TNM分期以及生存期呈相关。这些发现揭示了EPB41L3在食管鳞癌中表达下调的机制,并为EPB41L3在食管鳞癌中发挥抑癌作用提供了理论依据。抑癌基因的失活是参与肿瘤发生的一个重要机制,而甲基化又是抑癌基因失活的原因之一。该研究可能为食管鳞癌的早期诊断、监测提供依据,将为临床个体化诊疗提供参考。