论文部分内容阅读
猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)感染导致的母猪繁殖障碍性疾病严重制约着我国养猪业的发展,各品系及不同日龄的猪均可感染PPV,主要传染源是感染猪,因此建立能快速并准确诊断PPV感染的检测方法显得尤为重要。目前PPV的诊断最常用的检测方法包括血凝与血凝抑制试验、中和试验、病毒分离试验、乳胶凝集试验、免疫荧光试验和核酸探针检测技术等,但这些方法有的耗时长,有的需要特殊仪器设备、对专业技术要求高,有的检出率较低,有的成本高。本研究拟首先用PCR扩增PPV VP2全长,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli.BL21感受态中。然后在不同诱导时间、IPTG浓度和温度下诱导表达VP2融合蛋白,SDS-PAGE电泳切胶纯化VP2融合蛋白接种家兔,制备抗PPV VP2多克隆抗体。最后筛选PPV VP2双抗夹心ELISA诊断试剂盒最佳工作条件,并对其特异性、重复性、稳定性、灵敏度和符合率进行检测。试图研制出一种简便、快速、检出率较高和成本更低的PPV VP2双抗夹心ELISA诊断试剂盒,为快速并准确诊断PPV感染奠定基础。研究取得以下结果。1.PCR成功扩增928 bp和873 bp前段和后段DNA片段,融合PCR拼接得到1740bp VP2全长;将VP2与原核表达载体pET-32a连接,成功构建重组质粒,命名为pET-32a-VP2。优化后的VP2融合蛋白最佳表达条件为:37°C,IPTG诱导浓度1.0 mmol/L诱导表达4 h。并用SDS-PAGE切胶纯化VP2融合蛋白。2.纯化的VP2融合蛋白接种家兔后间接ELISA检测抗PPV VP2多克隆抗体效价可达1:12 800;制备的多克隆抗体稀释1:1 000倍后可与感染PPV的PK-15细胞总蛋白特异性结合;1:250倍稀释制备的多克隆抗体可与PPV发生特异性结合,而与猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)病毒未发生特异性结合。3.双抗夹心ELISA诊断试剂盒最佳工作条件:兔抗PPV VP2多克隆抗体最佳稀释度为1:3 200;单克隆抗体最佳稀释度为1:6 400;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG最佳稀释度为1:8 000;最佳酶标抗体作用时间为1 h;最佳封闭液为PBS稀释的5%脱脂牛奶;最佳封闭时间1 h;TMB底物最佳作用时间为15 min。将建立的PPV双抗夹心ELISA诊断试剂盒进行特异性、重复性、稳定性、灵敏度和符合率检测。与商品化PPV ELISA试剂盒相比,两者均仅与PPV病毒液反应,与PCV2、PRRSV和TGEV病毒液均不存在交叉反应;重复性检测表明本诊断试剂盒OD450nm值变异系数介于1.17%~3.24%,商品化PPV ELISA试剂盒OD450nm值变异系数介于1.04%~3.20%,均小于5.0%;稳定性检测表明本诊断试剂盒与商品化PPV ELISA试剂盒在37°C恒温箱连续测定7 d,两者OD450nm值均未出现明显变化;灵敏度检测表明本诊断试剂盒与商品化PPV ELISA试剂盒最低检出量均为102 TCID50;与商品化PPV ELISA试剂盒相比,本诊断试剂盒阳性符合率为92.3%,阴性符合率97.6%。本研究制备的试剂盒与PPV病毒液反应,与PCV2、PRRSV和TGEV病毒液均不存在交叉反应;OD450nm值变异系数介于1.17%~3.24%;37°C恒温箱连续7 d OD450nm值未出现明显变化;最低检出量均为102 TCID50;阳性符合率为92.3%,阴性符合率97.6%。研究结果将为我国规模化养猪业提供一种快速、方便、安全和成本低的PPV诊断试剂盒。