【摘 要】
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目的构建SARI基因过表达真核表达载体并完成鉴定,研究SARI基因过表达对CNE2鼻咽癌细胞生物学特性的影响并初步探讨相关分子机制。方法(1)获得并克隆SARI基因的全长cDNA序列,纯
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目的构建SARI基因过表达真核表达载体并完成鉴定,研究SARI基因过表达对CNE2鼻咽癌细胞生物学特性的影响并初步探讨相关分子机制。方法(1)获得并克隆SARI基因的全长cDNA序列,纯化后用BglII和XbaI内切酶进行双酶切消化,经T4 DNA连接酶作用,连接至pDsRed2-C-RFP真核表达载体;连接产物经转化、挑取克隆、扩增培养后,提取小量质粒,进行DNA测序鉴定,并用Bgl II和Xba I内切酶消化连接产物,琼脂糖凝胶电泳鉴定;重组质粒转染CNE2鼻咽癌细胞,荧光显微镜观察转染24h后SARI-RFP融合蛋白的表达,Western blot检测转染24h后SARI-RFP融合蛋白的表达。(2)pDsRed2-SARI-RFP真核表达载体转染至CNE2鼻咽癌细胞,通过CCK-8比色绘制生长曲线、Transwell小室侵袭实验、划痕修复实验、Caspase-3活性检测、DNA片段电泳检测等实验,观察SARI过表达对CNE2鼻咽癌细胞生长增殖、侵袭迁移和凋亡等生物学特性的影响。(3)Western blot检测内源性线粒体凋亡途径相关蛋白的表达变化。结果(1)成功扩增SARI基因全长cDNA序列,测序鉴定显示SARI基因全长cDNA序列已正确连接至pDsRed2-C-RFP载体;重组质粒加Bg1II和XbaI双酶切后,琼脂糖凝胶电泳鉴定pDsRed2-SARI-RFP真核表达载体构建成功;重组质粒转染至CNE2鼻咽癌细胞后可表达SARI-RFP融合蛋白。(2)SARI过表达组的CNE2鼻咽癌细胞生长增殖和侵袭迁移能力显著低于空载体对照组和空白对照组(P<0.05);SARI过表达组Caspase-3活性明显高于空载体对照组(P<0.05),出现明显的“梯状”DNA片段,诱导CNE2鼻咽癌细胞产生凋亡。(3)SARI过表达组与空载体对照组和空白对照组比较,Bcl-2表达下调,Bax、Cytochrome C表达上调,同时伴有凋亡途径相关蛋白Caspase-3和Caspase-9剪接激活以及PARP的表达上调。结论(1)成功构建了pDsRed2-SARI-RFP真核表达载体。(2)SARI基因过表达可明显抑制CNE2鼻咽癌细胞增殖和侵袭迁移能力,诱导细胞凋亡。(3)SARI基因可能通过激活线粒体内源性凋亡途径诱导CNE2鼻咽癌细胞凋亡,发挥抑癌作用。
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