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目的本课题旨在从阴阳和虚、痰、瘀的角度探讨阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）病机,阐明加减薯蓣丸防治AD的理论依据;通过行为学检测、免疫蛋白印迹、实时荧光定量PCR、免疫荧光染色、扫描电镜等方法,从持续激活的内质网应激介导神经元凋亡角度出发,探讨加减薯蓣丸通过调节内质网相关降解途径和自噬溶酶体途径对内质网应激的影响,明确加减薯蓣丸减轻APP/PS1双转基因小鼠神经元凋亡,改善学习记忆能力的作用机制。方法1.理论探讨:从中医基本概念阴阳和虚、痰、瘀的角度探讨中医对AD的认识;从加减薯蓣丸组方分析、前期研究基础、现代药理学机制三个方面阐明加减薯蓣丸干预AD的理论依据。2.实验一加减薯蓣丸通过PI3K/AKT/GSK3β通路上调Nrf2调控持续的内质网应激改善APP/PS1双转基因小鼠神经元凋亡在体实验:APP/PS1小鼠20只随机分为模型组和加减薯蓣丸组,野生型小鼠10只为对照组,加减薯蓣丸组给予14g/kg加减薯蓣丸煎剂灌胃,对照组和模型组以等量生理盐水灌胃,共四周。灌胃结束后,Morris水迷宫和新物体识别实验评价小鼠学习记忆能力。行为学后,灌注取脑切片观察小鼠海马神经元尼氏体;原位末端标记检测（TUNEL）观察海马神经元凋亡情况;新鲜海马组织用于Western Blot、ELISA及实时荧光定量PCR检测。Western blot检测GRP78、PERK,p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP、Cleaved Caspase-3、Nrf2蛋白表达,实时荧光定量PCR检测Nrf2、Hrd1、VCP和Os9 mRNA水平,ELISA检测Aβ42水平。离体实验:APP/PS1孕鼠分娩的新生小鼠（0-24h内）剪尾进行PCR扩增鉴定APP/PS1纯合子和野生型小鼠用于原代神经元培养,免疫荧光染色鉴定原代神经元纯度,MTT法检测不同浓度加减薯蓣丸（Modified Shuyu Pill,MSP）含药血清对细胞活性影响,APP/PS1纯合子背景原代神经元分为模型组、MSP组、MSP+衣霉素组、MSP+PI3K/Akt抑制剂组,野生型小鼠原代神经元作为对照组;对照组、模型组给予10%空白血清,MSP组给予5%MSP含药血清,衣霉素组和PI3K/Akt抑制剂组分别在MSP基础上加用2mg/L的衣霉素和10μmol/L的LY294002。Western blot检测GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP、Cleaved Caspase-3、p-Akt、Akt、GSK3β、Nrf2蛋白表达。3.实验二:加减薯蓣丸通过TFEB介导的自噬溶酶体途径参与调控APP/PS1小鼠神经元内质网应激在体实验:动物分组及干预同实验一,新鲜海马戊二醛固定进行扫描电镜观察,新鲜海马进行Western Blot检测:P62、LAMP1、CSTB、LC3II/LC3I、TFEB蛋白核内外表达水平。离体实验:将APP/PS1纯合子背景小鼠原代神经元分为模型组、MSP组、MSP+氯喹组,野生型小鼠原代神经元为对照组;MSP组给予5%MSP含药血清,MSP+氯喹组在MSP基础上加入25μmol/L的氯喹;免疫荧光检测细胞TFEB表达,Western Blot检测P62、LAMP1、CSTB、L3II/L3I、GRP78、p-PERK/PERK、GRP78、PERK、p-PERK、CHOP、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平。结果实验一在体实验:1.Morris水迷宫检测:定位航行1-4天,小鼠逃避潜伏期逐渐缩短;第4天,与模型组相比,加减薯蓣丸组逃避潜伏期缩短更明显（P<0.05）。空间探索实验显示:与模型组相比,加减薯蓣丸组穿越平台次数及平台象限停留时间占比增多（P<0.01）。2.新物体识别:再认识阶段,APP/PS1小鼠对新事物的探索时间较对照组下降,而经加减薯蓣丸干预后,小鼠对新物体探索时间增加,识别指数增加（P<0.05）。3.Nssil染色:对照组小鼠海马神经细胞尼氏体呈蓝紫色,细胞核呈蓝色,染色清晰;APP/PS1小鼠尼氏体数量减少,结构紊乱;加减薯蓣丸组小鼠尼氏体较模型组排列紧密,染色清晰。4.TUNEL染色:与对照组相比,模型组凋亡率增加;加减薯蓣丸降低海马CA1、DG区神经细胞凋亡率（P<0.01）。5.Western Blot检测:与对照组相比,模型组CHOP、Cleaved Caspase-3、GRP78、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α表达增加（P<0.05,P<0.01）;与模型组相比,加减薯蓣丸组CHOP、Cleaved Caspase-3、GRP78、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α表达下调（P<0.05,P<0.01）。与对照组相比,模型组Nrf2表达明显降低（P<0.01）;与模型组相比,加减薯蓣丸组Nrf2表达明显升高。6.实时荧光定量PCR检测:与对照组相比,模型组Nrf2、Hrd1,Os9 mRNA表达明显下降;与模型组相比,加减薯蓣丸组Nrf2、Hrd1,VCP和Os9 mRNA上调（P<0.05,P<0.01）。ELISA结果:与对照组相比,模型组海马区Aβ42水平升高（P<0.01）;与模型组相比,加减薯蓣丸组Aβ42水平明显降低（P<0.01）。离体实验:Western Blot检测:与模型组相比,MSP组GRP78、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP、Cleaved Caspase-3的表达有不同程度降低（P<0.05,P<0.01）;与MSP组相比,衣霉素组GRP78、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP、Cleaved Caspase-3水平增加（P<0.05）。与模型组相比,MSP组p-Akt/Akt、Nrf2表达明显升高（P<0.05,P<0.01）;与MSP组相比,PI3K/Akt抑制剂组p-Akt/Akt、Nrf2水平下降（P<0.05,P<0.01）。与模型组相比,MSP组GSK3β表达明显下降（P<0.01）;与MSP组相比,抑制剂组GSK3β水平增加（P<0.05）,GRP78、p-PERK/PERK、CHOP、Cleaved Caspase-3水平上调。实验二在体实验:电镜:与对照组相比,模型组自噬溶酶体增加,加减薯蓣丸干预后,海马区自噬溶酶体数量减少。Western Blot检测:与模型组相比,加减薯蓣丸组TFEB核内水平明显增加（P<0.01）,总TFEB水平无明显差异（P>0.05）。与对照组相比,模型组海马区LC3II/LC3I、P62水平升高（P<0.01）,cathepsin B（CTSB）、LAMP1蛋白水平降低（P<0.05,P<0.01）;与模型组相比,加减薯蓣丸组LC3II/LC3I无明显差异（P>0.05）,LAMP1、CTSB蛋白表达增加（P<0.01）,P62表达下调（P<0.01）。离体实验:TFEB免疫荧光:模型组TFEB在核内表达轻度增高;与模型组相比,MSP干预后,TFEB核内荧光强度明显增高。Western Blot检测:自噬相关蛋白:与对照组相比,模型组LC3II/LC3I、P62水平升高（P<0.01）,CTSB、LAMP1蛋白水平降低（P<0.05,P<0.01）;与模型组相比,MSP组LC3-II/LC3-I无明显差异（P>0.05）,LAMP1、CTSB蛋白表达增加（P<0.01）,P62表达下调（P<0.01）;与MSP组相比,MSP+氯喹组LC3II/LC3I,P62表达明显增加（P>0.05）,LAMP1、CTSB蛋白表达增加的趋势被明显抑制。与MSP组相比,MSP+氯喹组GRP78、p-PERK/PERK、CHOP、Cleaved Caspase-3水平上调（P<0.05,P<0.01）。结论1.脾肾亏虚、痰瘀互结是AD的基本病机,加减薯蓣丸的健脾补肾、化痰祛瘀治法具有可靠的理论基础。2.加减薯蓣丸提高APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆能力,减轻神经元凋亡,其机制可能是通过PI3K/Akt/GSK3β通路上调Nrf2表达,增加ERAD相关基因表达,降低海马Aβ42水平,减轻持续激活的内质网应激。3.加减薯蓣丸通过上调TFEB介导的自噬溶酶体通路,减轻内质网负荷,发挥对APP/PS1双转基因小鼠的神经保护作用。