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生物碱是杀虫植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）的主要活性成分,包括雷公藤次碱、雷公藤吉碱、雷公藤精碱和雷公藤春碱等。其中,雷公藤次碱的杀虫活性最强,对东方粘虫Mythimna separata Walker、小菜蛾Plutella xylostella及菜青虫Pieris rapae等多种害虫均具有较好的麻痹致死作用。随着雷公藤生物碱生物合成研究方面的突破,使得产业化制备雷公藤生物碱以用于生产雷公藤杀虫剂成为可能。然而,雷公藤次碱的杀虫机理尚不清楚,限制了该优秀杀虫剂的进一步开发和应用。前期症状学观察表明雷公藤总生物碱及次碱均可引起东方粘虫幼虫瘫软、麻痹、死亡,且明显引起体壁肌病变,初步推测其作用靶标可能存在于昆虫的肌肉系统,可能是新型神经-肌肉毒剂。鉴于此,本研究以雷公藤次碱为研究对象,以东方粘虫为供试昆虫,以商品化神经-肌肉毒剂氯虫苯甲酰胺为对照药剂,采用透射电镜观察了雷公藤次碱对粘虫肌肉组织结构的影响;进一步利用激光共聚焦显微技术测定了胞内钙离子动力学变化;在此基础之上,研究了雷公藤次碱引起的粘虫转录组水平的变化,并采用RNAi技术验证了候选靶基因鱼尼丁受体（RyR）基因在雷公藤次碱杀虫作用中的功能;最后利用同源建模和分子对接技术探索了其与疑似靶标的结合方式,以期初步明确雷公藤次碱的杀虫作用机理。主要研究结果如下:1、测定了雷公藤次碱对东方粘虫幼虫和成虫的胃毒活性,并对中毒粘虫的症状及组织病变进行了观察。结果表明:（1）雷公藤次碱对粘虫幼虫和成虫均具有较强的胃毒活性,对3龄和5龄幼虫48 h的LC50值分别为31.99和61.03 mg/L,对成虫的LC50值为53.46 mg/L;（2）雷公藤次碱引起试虫的典型中毒症状是瘫软、麻痹、死亡;且造成粘虫肌肉组织病变,对肌细胞膜及胞内细胞器（肌质网、线粒体等）均具有破坏作用。2、测定了雷公藤次碱对肌细胞的毒力,并以激光共聚焦显微技术结合Ca2+荧光指示剂测定了雷公藤次碱对肌细胞内[Ca2+]i的影响。结果表明:（1）CCK-8和MTT比色法测定的雷公藤次碱对粘虫肌细胞48 h的IC50分别为25.14和19.65μg/mL;（2）在1100nmol/L浓度范围内,雷公藤次碱可使胞内[Ca2+]i升高,且[Ca2+]i与雷公藤次碱的浓度呈正相关;在11000μmol/L浓度范围内,雷公藤次碱可使胞内[Ca2+]i降低,且[Ca2+]i与雷公藤次碱的浓度呈负相关;（3）雷公藤次碱可作用于肌质网上的RyR和三磷酸肌醇受体（IP3R）,引起肌质网钙库中的钙离子释放,使胞内[Ca2+]i升高;雷公藤次碱在RyR上的结合位点与咖啡因的结合位点不同,而可能与鱼尼丁的结合位点相同。3、采用转录组测序（RNA-seq）技术考察了雷公藤次碱对东方粘虫转录组水平的影响,并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对测序结果进行了验证。结果表明:（1）差异基因表达分析共得到1400个差异表达基因,其中453个上调,947个下调,与钙信号通路及肌肉收缩/舒张的基因表达量发生了显著变化;（2）qRT-PCR检测显示,与肌肉收缩/舒张及细胞组分有关的12个基因表达量与RNA-Seq结果一致,皮尔森相关系数R=0.889;（3）雷公藤次碱和氯虫苯甲酰胺对粘虫钙信号通路及肌肉收缩/舒张相关基因表达量具有显著影响,其中RyR基因随着雷公藤次碱剂量加大和处理时间的延长表达量降低,而随着氯虫苯甲酰胺剂量加大和处理时间的延长表达量升高。4、采用RT-PCR及RACE技术对东方粘虫RyR全长进行获取,并采用qRT-PCR的方法比较了RyR基因在粘虫不同发育阶段和不同组织中的表达水平。结果表明:克隆获得粘虫RyR基因全长为16258 bp,其中5’端非编码区308 bp,3’端非编码区578bp,开放阅读框15372 bp,编码5124个氨基酸;在粘虫不同发育阶段,RyR基因在5龄幼虫和成虫中的表达量较高;在不同组织中,RyR基因在头部和体壁肌肉组织表达量相对较高。5、利用RNAi技术验证了RyR基因在雷公藤次碱杀虫作用中的功能。合成了粘虫RyR基因的dsRNA片段（dsMsRyR1和dsMsRyR2）,显微注射36 h后的干扰率分别为47%和52%;干扰后试虫的生长发育受到明显抑制,48 h的体重分别下降40.46%和43.07%,但试虫死亡率与对照相比并未显著上升;用LC50剂量的雷公藤次碱和氯虫苯甲酰胺处理注射dsMsRyR2 36 h后的试虫,48 h后的死亡率分别为33.33%和30%,说明注射dsMsRyR后试虫对雷公藤次碱和氯虫苯甲酰胺的敏感性下降,RyR可能是雷公藤次碱的作用靶标。6、采用同源建模和分子对接技术探索了雷公藤次碱在RyR上可能的结合位点。研究表明雷公藤次碱和氯虫苯甲酰胺均可与粘虫RyR N-端结构域（MsRyRNTD Pocket 1）、RyR SPRY1结构域（MsRyRSPRY1）及RyR和IP3R共有的高度保守区域（MsRIH2）结合;且雷公藤次碱在MsRyRNTD Pocket 1和MsRIH2的结合能力较强,预测MsRyRNTD Pocket 1处的Arg51、Gly74、Asn75、His106及Ser108五个氨基酸残基,及MsRIH2处的Arg2344、Asp2350和Arg2406三个氨基酸残基可能是雷公藤次碱的结合位点。综上,对雷公藤次碱作用机理推测如下:雷公藤次碱经昆虫取食进入虫体,到达肌细胞后,与肌质网上的RyR和IP3R结合,影响钙库中钙离子的释放,导致胞内钙稳态失衡;钙离子浓度的失衡引起肌细胞结构受损,乃至坏死或凋亡;进一步导致肌肉组织结构破坏,影响其功能,中毒试虫出现肌肉瘫软、麻痹等症状,逐步死亡。RyR可能是雷公藤次碱的主要作用靶标,IP3R也可能是其作用靶标之一。