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研究背景：瘢痕是创伤后纤维组织代替正常皮肤组织的结果,它是一种组织过度修复的必然产物。在瘢痕形成机制中包含了一个重要机制——瘢痕内血管生成机制,异常的血管生成可能是导致异常瘢痕组织增生的关键因素。近年来血管生成在瘢痕形成中的作用逐渐被人们重视,成为瘢痕机制研究的热点。整合素连接激酶(integrin-linked kinase, ILK)是新发现的一种丝氨酸/苏氨酸激酶,它可以介导整合素与细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的连接,实现胞外信号向胞内传递,同时它也可以作为整合素与生长因子信号通路之间的桥梁,参与各种生长因子的合成与分泌。ILK在哺乳动物体内分布广泛,参与多种疾病的发生,在肿瘤形成、组织纤维化过程中有较多的研究。也有研究表示ILK可能对血管形成具有促进作用,目前ILK对瘢痕血管形成作用的机制尚未见报道,本研究目的是通过体外实验探讨ILK在瘢痕内血管生成中的作用机制。通过体外分离培养瘢痕微血管内皮细胞,分别观察ILK对瘢痕血管内皮细胞的增殖及细胞周期影响；ILK对瘢痕成纤维细胞VEGF的合成、分泌及其对瘢痕微血管内皮细胞KDR mRNA、Flt-1 mRNA表达的影响；以及研究缺氧环境对瘢痕微血管内皮细胞ILK表达的调控影响,从细胞增殖、环境影响及生长因子受体信号通路方面证明ILK对瘢痕内血管生成的作用,以探讨ILK在瘢痕血管形成中的作用机制。第一部分ILK对增生性瘢痕微血管内皮细胞增殖及细胞周期作用的研究目的探讨小分子干扰RNA技术(siRNA)对ILK的表达作用及对人瘢痕微血管内皮细胞(HSMECs)增殖及细胞周期的影响。方法手术切取8例人增生性瘢痕标本应用Ⅰ型胶原酶法分离培养瘢痕微血管内皮细胞(HSMECs),并通过FRAVIII免疫荧光标记及PCR定性检测血管内皮细胞表面特异性受体KDR、Flt-1基因。设计及合成靶向ILK基因的siRNA序列,InterferinTM介导ILK siRNA转染HSMECs。实验分为①对照组,②nterferin组,③LK con-siRNA组,④LK siRNA组。Western blot法观察ILK蛋白的表达,XTT法和流式细胞技术观察HSMECs增殖及周期的变化。结果Western blot结果显示ILK siRNA可以抑制HSMECs中ILK蛋白的表达。XTT实验结果显示ILK siRNA组细胞增殖水平,明显低于其他组(F=164.154,P=0.000)；流式细胞技术检测结果显示与对照组相比ILK siRNA组G1期细胞比例显著增高,S期细胞比例显著降低(P<0.05)。结论ILK siRNA可以在蛋白水平上干扰瘢痕微血管内皮细胞ILK的表达,由此导致HSMECs的增殖受抑,并在细胞周期水平上阻止G1期向S期进展,推论ILK可能是促进瘢痕微血管内皮细胞增殖及调控内皮细胞周期的关键因素。第二部分ILK对增生性瘢痕中的VEGF及其受体作用的研究目的探讨ILK对人增生性瘢痕成纤维细胞VEGF的分泌及人瘢痕微血管内皮细胞KDR mRNA、Flt-1 mRNA表达的调控作用。方法手术切取人增生性瘢痕标本采用组织块法分离培养瘢痕成纤维细胞(hFBs), I型胶原酶法分离培养瘢痕微血管内皮细胞(HSMECs),选取第5-6代细胞备用。将这两种细胞均分为3组：①对照组；②空质粒组；③LK cDNA表达质粒转染组。采用免疫细胞化学法、RT-PCR、Western、ELISA法观察VEGF的合成与分泌情况,并按上述分组处理HSMECs,应用RT-PCR分析KDR mRNA和Flt-1 mRNA的表达。结果免疫细胞化学染色结果显示经ILK cDNA转染细胞后,VEGF; RT-PCR与Western blot结果显示ILK cDNA转染组的VEGF mRNA及VEGF蛋白表达均高于对照组和空质粒组(P<0.05); ELISA法检测ILK cDNA转染组的VEGF蛋白含量高于其他两组(P<0.05)。经ILK cDNA转染的瘢痕微血管内皮细胞上的KDR mRNA、Flt-1 mRNA表达均高于对照组(P<0.05)结论ILK可以在转录和翻译水平上对瘢痕成纤维细胞VEGF进行上调控制,并且促进成纤维细胞VEGF的分泌；同时ILK也对瘢痕微血管内皮细胞KDR mRNA和Flt-1mRNA的表达有一定的上调作用,由此推论ILK可能通过加强VEGF与其受体的结合作用,促进增生性瘢痕血管生成。第三部分缺氧对瘢痕微血管内皮细胞生长及ILK表达调控作用的研究目的探讨二氯化钴(CoCl2)诱导的化学缺氧条件对瘢痕微血管内皮细胞生长及ILK表达的影响。方法利用CoCl2诱导体外化学缺氧,以不同浓度的CoCl2作用于瘢痕微血管内皮细胞,分别采用XTT比色法检测细胞增殖、RT-PCR法检测ILK mRNA、HIF-1αmRNA表达、Western blot检测一定浓度的CoCl2在不同时间点ILK蛋白的变化。结果XTT检测发现CoCl2 60μmol/L浓度刺激的细胞增殖水平最高,而后随着浓度的增加,细胞增殖出现抑制；RT-PCR检测见低浓度的CoCl2对ILK mRNA表达有促进作用,高浓度CoCl2对ILK mRNA表达有抑制作用,而HSMECs的生长趋势与ILK的表达变化相似。Western blot检测显示在CoCl2 60μmol/L浓度作用下,不同时间点ILK蛋白的变化,其中0h为正常表达,1h表达较弱,2h-24h ILK蛋白表达逐渐增强。结论缺氧环境是诱导瘢痕微血管内皮细胞ILK变化的重要因素,轻度缺氧对细胞生长及ILK表达具有促进作用,在异常的缺氧环境下可转为抑制。ILK可能是通过缺氧信号通路作用于瘢痕血管内皮细胞的生长,从而促进瘢痕血管的生成。