【摘 要】
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为了阐明Fas-FasL在MS中介导自身反应性T细胞的删除机理,我们进行了下列三部分实验.主要内容和结果如下:第一部分,膜FasL的纯化及其凋亡诱导功能的鉴定;我们应用亲和层析柱,
【出 处】
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上海第二医科大学 上海交通大学医学院 上海交通大学
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为了阐明Fas-FasL在MS中介导自身反应性T细胞的删除机理,我们进行了下列三部分实验.主要内容和结果如下:第一部分,膜FasL的纯化及其凋亡诱导功能的鉴定;我们应用亲和层析柱,从表达FasL的HepG2细胞膜蛋白抽提液中分离纯化FasL分子.实验证明用本法纯化的FasL分子量为31~33kD,SDS-PAGE呈现单一条带,Western-Blot表明所提取的膜蛋白为人FasL.细胞学检测该蛋白能诱导表达Fas的细胞发生凋亡,并且在一定浓度范围内呈现量-效关系.第二部分,FasL胞外区(sFasL)基因的原核表达及其产物的免疫活性测定;我们将FasL胞外区编码基因克隆入表达载体pQE-31,转化大肠杆菌DH5α,经大量培养,IPTG诱导表达,沉淀被裂解后,再经Ni-NAT亲和层析,制备了纯度较高的sFasL蛋白,SDS-PAGE电泳显示了在20kD处有一单一条带,经Western-Blotting鉴定,能与抗FasL抗体结合.随后我们再用PIERCE公司的内毒素去除胶去除内毒素,进行凋亡诱导功能的检测,显示了活性,但相对较弱.第三部分,FasL诱导EAE淋巴细胞凋亡的实验研究.为了阐明Fas-FasL是否参与了MS中自身反应性T细胞的删除,我们用人髓鞘碱性蛋白(MBP)加福氏完全剂,诱导KM小鼠,建立了MS的动物模型-实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE),分析了EAE淋巴细胞膜上Fas及FasL分子的表达,并检测了分泌的细胞因子,分别用所制备的人FasL及糖皮质激素甲泼尼龙诱导EAE淋巴细胞凋亡.
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