细胞凋亡是一种由基因控制的主动性的细胞死亡过程，它对于维持机体内环境的稳定是至关重要的。RIP3(receptor—interacting protein 3)是RIP丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，它具有自磷酸化、诱导细胞凋亡和激活NF-κB的作用。此外，RIP3还能通过其C端独特的结构域与RIP结合并募集到TNFR1信号转导复合物中。但到目前为止，关于RIP3的细胞定位以及促凋亡的分子机制仍不清楚。前人的研究已经表明：RIP3的N端的激酶结构域对于其激酶活性和自磷酸化是必需的，而C端的独特结构域对于其促凋亡活性和激活NF-κB的功能是非常关键的。为了研究其促凋亡的具体机制，我们将RIP3的C端作为研究的重点。我们发现过量表达一个仅包含RIP3的C端从224位到518位氨基酸的缺失突变体，RIP3△N223(tRIP3)，就可以在人肝癌细胞系QGY-7703中诱导显著的细胞凋亡。FADD是死亡受体介导的细胞凋亡通路中的关键成员，FADD的显性负性突变体(FADD-dominant negative，FADD-DN)可以在多种细胞系中阻断TNF-α，Fash，或TRAIL激活的死亡受体通路。为了探讨FADD与RIP3在TNFR1信号通路中的相互关系，我们研究发现FADD-DN能明显阻止tRIP3诱导的凋亡；然而RIP3的显性负性突变体(RIP3-dominant negative，RIP3-DN)却不能阻止FADD诱导的凋亡。因此我们推断在TNFR1介导的凋亡信号通路中，tRIP3可能在FADD的上游发挥作用。意外的是：FADD-DN不能阻止RIP3诱导的凋亡。这种差别暗示全长的RIP3与tRIP3可能通过不同的通路诱导凋亡。考虑到已经有文献报道RIP家族的RIP和RIP4会在死亡受体诱导的凋亡途径中被半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶caspase剪切，我们设想RIP3也会有类似的情况。与预期一致，我们发现在人宫颈癌细胞系HeLa中，RIP3分子会在凋亡刺激下被Caspase-8于天冬氨酸D328位后剪切，这个剪切过程可以被广谱的caspase抑制剂Z-VAD-FMK完全抑制，而不能被Caspase-8特异性的抑制剂Z-IETD-FMK所抑制，提示RIP3还可能被其它的分子剪切。全长的RIP3可以同时诱导caspase依赖和非依赖的细胞凋亡，同时还可以激活NF-κB。剪切后产生的两个片段分别包含完整的激酶结构域(N端片断，RIP3-N，aa 1-328)和主要的独特结构域(C端片断，RIP3-C，aa 329-518)。全长RIP3主要在胞质中弥散分布；RIP3-N在整个细胞中都均匀分布；RIP3-C在低表达的情况下保留了RIP3的定位方式，但高表达时可在细胞质中形成点状或丝状的结构。RIP3-N丧失了全长RIP3的一些生理活性，如促凋亡和激活NF-κB；RIP3-C保留了这两种功能但有所改变。RIP3-C只能诱导caspase依赖的细胞凋亡，而且RIP3-C比RIP3诱导NF-κB激活的能力强得多。值得注意的是，外源的RIP3是一个不稳定的蛋白，它的两个剪切片断比全长RIP3的稳定性强，暗示了RIP3的两个结构域对于其不稳定性都有贡献。我们还观察了RIP3的点突变对其功能的影响。RIP3不被剪切的突变体，RIP3(D328A)，表现出与野生型RIP3相似的细胞定位和促凋亡能力。RIP3的赖氨酸K50位对于它的激酶活性和ATP结合都很关键，在RIP家族中十分保守。RIP3(K50A)，一个失去激酶活性的点突变体，与去掉激酶结构域的RIP3-C一样，只能诱导caspase依赖的细胞凋亡，这暗示了RIP3的激酶活性对于其诱导的caspase非依赖的凋亡是必需的。本实验室以前的工作阐明了RIP3是一个核质穿梭蛋白，我们发现RIP3(D328A)也可以进行核质穿梭。有趣的是，RIP3(K50A)与RIP3-N都丧失了核质穿梭能力。RIP3-C在胞质弥散分布时可以核质穿梭，然而一旦形成了点状或丝状结构则不能进行核质穿梭。这些结果表明RIP3的核质穿梭与其诱导caspase非依赖的凋亡能力是密切相关的。我们还发现RIP3和RIP3(D328A)在凋亡时均可从胞质进入到细胞核，暗示了RIP3可能在细胞核中诱导caspase非依赖的细胞凋亡。