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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的以猪群发生繁殖障碍和呼吸道症状为主的一种急性、高度传染性的病毒性重大传染病。Sub-lineage 1、Sub-lineage 5、Sub-lineage 8等PRRSV谱系毒株是近年国内的流行毒株。NADC30类PRRSV毒株属于Sub-lineage 1,其基因组极易发生重组,该类毒株传入我国后演化出具有地方特色的NADC30类PRRSV毒株,且该类毒株无针对性疫苗可用。本研究开展了四川地区PRRSV分子流行病学调查、流行毒株分离鉴定和致病性研究,构建了表达NADC30类PRRSV GP5和M蛋白的重组伪狂犬病毒,研究了重组伪狂犬病毒的生物学特性、靶向递送抗原能力,并通过接种小鼠、猪评价了重组伪狂犬病毒的安全性和免疫原性,为NADC30类PRRSV毒株疫苗的研发奠定基础。主要研究内容如下:1.四川地区PRRSV分子流行病学调查及流行毒株的分离鉴定和致病性分析2016～2020年从四川地区13市中采集的539个样本中检测到282份PRRSV核酸阳性样本,首次在四川地区检测到PRRSV-1阳性样本。结合NCBI中四川地区获得的PRRSV-2 ORF5基因序列开展系统发育分析发现四川地区共有5种亚型的PRRSV-2毒株,分别是Sub-lineage 8.7（60.71%）、Sub-lineage 5.1（11.31%）、Sub-lineage1.8（18.45%）、Sub-lineage 1.5（2.97%）、Sub-lineage 3.5（6.55%）。本研究共计分离PRRSV流行毒株16株,同源重组分析发现4株NADC30类PRRSV毒株存在基因重组。NADC30类PRRSV CHSCDJY-2019毒株致病性分析证明其为中毒力毒株,能够导致感染仔猪出现PRRSV典型临床症状和高水平病毒血症,感染仔猪均未死亡。2.表达NADC30类PRRSV GP5和M蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及生物学特性分析本研究通过RT-PCR扩增PRRSV CHSCDJY-2019株的ORF5和ORF6基因片段,引入裂解肽编码核酸序列后通过同源重组技术插入p EGFP-g I/28K载体成功构建转移载体p EGFP-2A-NC-OFR5-6。通过同源重组、Crispr/cas9基因敲除技术获得重组病毒,空斑纯化后获得纯净的重组病毒rPRV-NC56。Western Blot和IFA鉴定结果显示rPRV-NC56能够有效表达目的蛋白。rPRV-NC56感染细胞的透射电镜观察证明外源基因插入和表达不会影响PRV病毒粒子的装配和形态,感染细胞胞质囊泡中观察到与PRRSV病毒粒子大小、形态相似的直径约为40～60 nm的PRRSV病毒样颗粒（VLPs）。rPRV-NC56的生物学特性与亲本毒株无显著差异,其病毒毒价为108.52TCID50/m L。细胞连续传代试验证明rPRV-NC56毒株遗传稳定性良好,外源基因插入和毒力基因缺失稳定。3.rPRV-NC56小鼠安全性和免疫原性评价研究评估了重组伪狂犬病毒rPRV-NC56在小鼠体内的安全性和免疫原性评价。结果显示,rPRV-NC56接种后小鼠无临床表现和死亡,血清中IL-6和TNF-α无显著上调,脑组织无明显病理变化。rPRV-NC56接种小鼠后能够诱导高水平PRV和NADC30类PRRSV特异性免疫反应,可保护小鼠够抵抗PRV野毒致死剂量攻击。加强免疫后4周,rPRV-NC56免疫小鼠血清中的针对NADC30类PRRSV的中和抗体效价（1:13.64）显著高于HP-PRRSV（1:6.82）。rPRV-NC56免疫小鼠脾细胞NADC30类PRRSV灭活抗原刺激组的增殖指数（SI值）极显著高于HP-PRRSV灭活抗原刺激组。4.rPRV-NC56诱导黏膜免疫应答机制研究通过免疫组化（IHC）、q PCR和免疫荧光分析了重组病毒肌肉注射和滴鼻免疫在小鼠体内定植、靶向递送抗原、诱导黏膜组织中免疫细胞分化和迁移情况。结果表明,rPRV-NC56滴鼻免疫较肌肉注射在肺脏、肠道等黏膜组织中的定植时间早、病毒载量高,而脾脏、肾脏中则是肌肉注射免疫定植时间更早、病毒载量更高。rPRV-NC56在肺脏和肠道中能够靶向递送抗原至上皮细胞、DCs、巨噬细胞等APCs。滴鼻免疫较肌肉注射免疫能够诱导肺脏和肠道中MCP-1表达量上调和DCs、单核细胞、巨噬细胞、CD4+T淋巴细胞、CD45+白细胞数量显著上升,能诱导肺脏和肠道中s-Ig A分泌细胞数量显著上升。rPRV-NC56滴鼻免疫在加强免疫后较肌肉注射免疫能够诱导更高水平的PRV和NADC30类PRRSV特异性体液免疫和细胞免疫。5.rPRV-NC56猪体内安全性和免疫效果评价通过接种初生仔猪、妊娠母猪评价rPRV-NC56的安全性。初生仔猪肌肉注射和滴鼻接种10~8TCID50/m L的rPRV-NC56后未出现临床表现,生长状况正常;妊娠母猪接种10~8TCID50/m L的rPRV-NC56后无临床表现,接种母猪产仔数、健仔数等与对照组无显著差异;哨兵仔猪和母猪g B和GP5蛋白抗体检测均为阴性。通过肌肉注射和滴鼻免疫断奶仔猪,从体液免疫、细胞免疫及攻毒保护评价rPRV-NC56免疫效果。rPRV-NC56肌肉注射和滴鼻免疫在加强免疫后2周可诱导仔猪产生高水平PRV特异性中和抗体（1:70.30和1:91.38）和PRRSV特异性中和抗体（1:18.31和1:20.7）,各组仔猪PRV g E和PRRSV N蛋白抗体检测结果均为阴性。加强免疫后2周,各组仔猪分别攻毒PRV-XJ株和PRRSV CHSCDJY-2019株。rPRV-NC56免疫后对PRV的攻毒保护率为100%;rPRV-NC56免疫能够极大减轻NADC30类PRRSV毒株感染造成的临床表现和NADC30类PRRSV造成的病毒血症、降低各组织中PRRSV病毒载量,其免疫仔猪攻毒后肺脏和肺门淋巴结无明显病理变化。