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背景与目的干细胞移植在中枢神经系统及心血管系统等多系统疾病治疗的研究领域中取得了显著地进展,但干细胞与肿瘤细胞关系密切,都具有自我更新和多向分化能力,不仅有相似的代谢活性,而且有很多相同的沉默基因。近年来关于干细胞成瘤的报道使干细胞移植安全性被质疑,而且移植部位常发生在脊髓、脑、眼等较敏感的部位,即使形成很小的肿瘤都会导致严重的功能障碍,移植后干细胞的示踪可尽早检测到肿瘤的发生。在干细胞活体影像学示踪领域,主要利用光学、核医学以及磁共振成像(MRI),其中,MRI因具有三维多序列成像且高分辨率无辐射等优点而最具潜力。MRI示踪干细胞常用方法包括直接和间接两种方法,直接示踪法应用磁性纳米微粒先标记干细胞并利用MRI对磁标记细胞进行检测,但是由于细胞的分裂及再摄取等问题限制其对干细胞的长期纵向示踪;间接示踪法常采用MRI报告基因标记干细胞,并利用其在细胞内的持续表达来示踪干细胞,有效克服了直接示踪法不能对细胞进行长期示踪的缺陷。虽然MRI报告基因成像可实现对干细胞移植后的长期纵向示踪,但无法区分早期瘤变细胞和瘤变前的干细胞。解决这一问题的关键在于找到一种在干细胞瘤变前后差异化表达的基因,该基因在瘤变细胞内高表达,而在干细胞及其正常分化的组织细胞不表达或低表达,利用该基因的启动子驱动报告基因在瘤变细胞内特异性表达,理论上可以实现报告基因成像对干细胞瘤变的早期检出。PEG3(progression elevated gene-3)是一种来源于啮齿动物的肿瘤特异性基因,在肿瘤细胞中,PEG3启动子活性受到PEA3、AP-1两种转录因子的调节而高表达。该基因在人癌细胞系同样高表达,而在正常组织细胞极少表达;目前PEG3启动子已被用于肿瘤的靶向治疗和肿瘤的发生机制等研究领域。有关利用PEG3启动子驱动报告基因对干细胞瘤变进行活体成像的研究尚未见文献报道。本实验将肿瘤特异性启动子PEG3与MRI报告基因FTH1相结合,构建PEG3-FTH1-LV慢病毒载体,将PEG3-FTH1系统转入大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)内,并诱导MSCs瘤变,在诱导前后观察FTH1基因表达、聚铁效应以及MRI信号改变,探究利用PEG3启动子驱动MRI报告基因FTH1在干细胞瘤变时特异性表达及聚铁,并被MRI检测的可行性。方法1 PEG3-FTH1-LV慢病毒载体的构建及病毒包装PEG3启动子、FTH1基因(委托汉恒生物有限公司合成)与载体p HBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZSgreen-puro通过酶切、扩增、连接得到pHBLV-PEG3-FTH1-3flag-EF1-ZSgreen-puro,测序鉴定构建成功后与质粒(p SPAX2、p MD2G)同时感染293T细胞,收集病毒液离心得到病毒并标记为PEG3-FTH1-LV。同时构建CMV-FTH1-LV作为阳性对照,并将未感染病毒的MSCs细胞作为阴性对照。2慢病毒感染MSCs并诱导瘤变待MSCs细胞融合度达30%-40%,分别添加含PEG3-FTH1-LV、C MV-FTH1-LV病毒培养基,感染48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,嘌呤霉素筛选构建稳定表达株MSCs-PEG3-FTH1、MSCs-CM V-FTH1。将MSCs、MSCs-PEG3-FTH1、MSCs-CMV-FTH1分别与大鼠胶质瘤细胞C6间接共培养2周诱导其瘤变为TMSCs、TMSCs-PEG3-FTH1、TMSCs-CMV-FTH1。3诱导前后细胞的鉴定观察共培养前后细胞形态,细胞流式检测共培养前后细胞表面抗体CD29、CD34、CD45、CD90表达情况,结晶紫染色检测诱导前后细胞迁移能力,CCK-8检测诱导前后细胞增殖速度,裸鼠皮下成瘤实验验证细胞瘤变。4诱导前后细胞FTH1表达及聚铁Western blots检测诱导前后细胞FTH1表达,诱导前后细胞分别经FAC培养基作用72h后,3.0T MRI观察细胞T2WI信号,普鲁士蓝染色、细胞透射电镜观察细胞诱导前后FTH1基因表达所引起的聚铁效应。5诱导后细胞移植物聚铁效应检测选取4-6W、20g左右健康雄性裸鼠,将诱导后细胞种植于裸鼠颈背部皮下,每天500mmol/L FAC溶液喂养,于细胞种植后第1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d行3.0T MR观察移植物T2WI信号;细胞移植后形成的移植物取出后行普鲁士蓝染色及透射电镜观察肿块内铁颗粒情况,行苏木素-尹红染色观察其病理结构。结果1 PEG3-FTH1-LV慢病毒载体的鉴定及病毒包装经DNA测序、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳等技术测定已成功构建PEG3-FTH1-LV慢病毒载体,病毒滴度为1×108TU/ml。2稳定株的建立慢病毒感染细胞48h后绿色荧光明显表达,嘌呤霉素筛选7天再半量筛选3天后成功构建MSCs-PEG3-FTH1、MSCs-CMV-FTH1稳定株。3诱导前后细胞的鉴定显微镜下观察到MSCs细胞排列整齐,呈鱼群样生长,TMSCs细胞较MSCs细胞变小,核浆比变大,并排列紊乱;经CCK-8检测显示TMSCs细胞较MSCs细胞增殖速度加快;结晶紫染色结果显示TMSs细胞较MSCs细胞迁移能力增强;流式细胞检测结果分析得到TMSCs细胞较MSCs细胞CD34、CD45表达增加,CD90表达减少;裸鼠皮下成瘤实验显示TMSCs细胞裸鼠皮下成瘤阳性,而MSCs不形成肿瘤。4诱导前后细胞FTH1表达及聚铁效应Western blots结果显示MSCs、MSCs-PEG3-FTH1、TMSCs细胞不表达或少量表达FTH1蛋白,而MSCs-CMV-FTH1、TMSCs-PEG3-FTH1、TMSCs-CMV-FTH1细胞均大量表达FTH1蛋白,MRI显示T MSCs-PEG3-FTH1细胞T2WI信号较MSCs-PEG3-FTH1细胞明显降低。普鲁士蓝染色和细胞透射电镜观察到MSCs-CMV-FTH1、TMSCsPEG3-FTH1、TMSCs-CMV-FTH1细胞内存在铁颗粒,而在MSCs、M SCs-PEG3-FTH1、TMSCs细胞内无明显铁颗粒。5诱导后细胞移植物体内聚铁效应MRI显示TMSCs-PEG3-FTH1细胞移植物信号与TMSCs-CMV-FT H1细胞移植物信号相似且均较TMSCs细胞移植物信号降低,普鲁士蓝染色和细胞透射电镜均观察到TMSCs-PEG3-FTH1与TMSCs-CMVFTH1细胞移植物内有明显的铁颗粒而TMSCs细胞移植物内铁颗粒不明显。结论本实验成功构建PEG3启动子控制FTH1基因表达的慢病毒载体并感染MSCs细胞,证实了PEG3启动子可驱动报告基因FTH1在干细胞瘤变时特异性表达并能被MRI检测。