[研究背景和目的]先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)是人类最常见的出生缺陷疾病,是导致婴幼儿非感染性疾病中最主要的死亡原因。法洛四联症(Tetralogy of Fallot,TOF)是最常见的复杂性、紫绀性CHD,其死亡率较高,在10岁内,未经治疗的患者死亡率高达70-75%,但是由于目前缺乏相应的疾病模型,TOF的基因学、细胞学及分子学病因仍未明确。因此,我们需要一种新的工具或疾病模型系统来对TOF进行研究,使我们更好的探索其发生及发展过程中的病理生理学机制。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是利用重编程技术向体细胞内导入重编程因子得到的一种具有与胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESCs)相似的全能性的细胞,基于其明确的基因背景等特点,iPSCs为发育生物学及遗传疾病的病因生物学的研究提供了一种全新的思路。在心血管疾病的研究中,由于其能较好的保留样本的遗传背景,同时能很好的模拟心脏的发育过程,iPSCs为探索遗传变异导致的心脏发育异常提供了一个独特的细胞平台。基于以上理论,我们拟建立来自于TOF及健康对照的iPSCs细胞系,为探索TOF的疾病机理建立一个良好的平台。然后,诱导iPSCs向心肌细胞分化,比较TOF及健康对照在细胞水平的功能差异。最后,基于心肌细胞模型研究TOF在心肌发育阶段的转录调控机制。[方法]第一部分:采集TOF及健康对照组的皮肤组织,通过组织块贴壁法获取皮肤成纤维细胞;使用仙台病毒作为载体将经典的“OCT3/4,SOX2,Klf4及c-Myc”4种重编程因子导入原代培养的皮肤成纤维细胞中,采用无血清及无滋养层细胞的方法进行iPSCs的诱导;进一步使用碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、流式细胞术及qPCR等方法对iPSCs的多能性基因及蛋白进行检测,同时使用G显带核型分析法对细胞的核型进行分析;最后,使用体内畸胎瘤形成实验,对iPSCs的多向分化潜能进行检测。第二部分:通过使用小分子化合物CHIR99021及IWP-2对Wnt通路进行干预并结合维生素C及BMP4等使用单层细胞分化的方法诱导上述iPSCs向心肌细胞分化,进一步通过乳酸代谢的方法对其进行纯化后,使用免疫荧光、流式细胞术及qPCR等方法对诱导后的心肌细胞的特异性基因及蛋白表达进行检测,同时使用透射电镜对其超微结构检测;然后,通过CCK8及Ki67染色对不同组别的心肌细胞的增殖功能进行检测,并使用划痕实验对细胞的迁移能力进行检测。第三部分:收集iPSCs诱导分化后的心肌细胞(每株iPSCs进行三次独立的诱导分化后收集细胞),对细胞转录组进行提取扩增后,使用高通量测序技术对样本进行测序,对测序后的数据进行分析,寻找TOF组和健康对照间的差异表达基因,通过生物信息学分析探索关键的差异基因,并使用qPCR对关键差异基因MYL2、BMP10、CXCL12等进行验证。进一步使用siRNA敲低AC16心肌细胞中关键差异基因BMP10的表达,对成功敲低BMP10的心肌细胞使用CCK8及EdU染色检测细胞增殖能力,使用划痕实验检测迁移能力,以明确BMP10在心肌细胞中的作用;最后使用Western blot及qPCR对其下游调控的关键通路及分子进行研究。[结 果]第一部分成功构建iPSCs:通过使用组织块贴壁法,我们成功获取了 3例TOF及2例健康对照的皮肤成纤维细胞,且5株细胞均有较好的增殖活性;采用仙台病毒携带经典的“OSKM”重编程因子,我们成功将上述5株成纤维细胞诱导为具有与ESCs形态相似的克隆状的iPSCs。在培养过程中发现其中2株TOF组及1株健康对照组iPSCs有较好的克隆形态及增殖效率,而其余2株细胞活性较差且出现了明显的自分化现象;因此,我们选择生长较好的3株细胞进行鉴定及研究,首先3株iPSCs碱性磷酸酶染色均为阳性;免疫荧光、流式细胞术及qPCR检测多能性基因或蛋白OCT4、Nanog等均高表达;细胞核型经传代培养20代以后表型正常;畸胎瘤形成实验证实3株细胞具有较好的三胚层分化能力。第二部分iPSCs诱导分化为心肌细胞:使用干预Wnt通路结合维生素C及BMP4的方法成功将3株细胞定向分化为可自发搏动的心肌细胞,且该方法诱导效率较高,三株细胞均高于80%,组间无差异;同时使用乳酸代谢的方法成功将3株分化后的心肌细胞阳性率纯化至接近于95%;分化后的心肌细胞免疫荧光染色显示心肌特异性蛋白CTNT及α-actinin均高表达,qPCR检测显示心肌特异性基因表达水平显著增高;TOF组及健康对照来源的心肌细胞在细胞体积、搏动效率、离子通道基因的表达及超微结构上无显著差异;然而CCK8及Ki67染色显示TOF来源的心肌细胞相对于正常组增殖能力降低,其中TOF-1组显著降低;同时划痕实验发现TOF组来源的心肌细胞迁移能力也显著降低。第三部分iPSCs来源的心肌细胞转录组测序分析及关键差异基因功能研究:在TOF组与对照组间共筛选出差异表达的基因1388个,相对于健康对照组,TOF组表达上调的基因1006个,表达下调的基因382个;通过对差异表达基因的GO富集分析,我们发现表达下调的差异基因显著富集于与心脏的发育相关的term中,进一步的生物信息学分析发现MLY2、BMP10、CSRP3、TBX5、TBX20、WNT2、ISL1、CXCL12、TNF、SNAI1、S1PR1及SERP1NE1等基因位于局部基因簇的中心位置;通过使用qPCR对差异基因进行验证后,我们发现MLY2、CSRP3、BMP10、TBX5、TBX20、CXCL12、TNF及SERPINE1等基因在 TOF 组中的表达量显著低于健康对照。进一步使用人心肌细胞AC16验证BMP10基因功能发现:敲低AC16中的BMP10基因后,其增殖能力显著下降,而迁移能力无明显改变。进一步对其下游调控机制分析发现BMP10敲低后Smad1/5及Erk1/2的磷酸化水平下调,下游的转录因子TBX5及TBX20的表达水平下调。同样,在iPSCs-TOF组中心肌细胞的p-Smad1/5、p-Erk、TBX5及TBX20的表达水平也下调。[结论]1.本研究成功构建TOF及健康对照来源的具有多向分化潜能iPSCs,可作为疾病模型从细胞水平探索TOF的发病机制。2.TOF来源的iPSCs在心肌细胞分化效率上与健康对照无差异;而TOF组来源心肌细胞增殖能力及迁移能力降低,我们推测在心脏发育过程中,心肌细胞的增殖能力及迁移能力的异常可能参与了 TOF的发生。3.通过对心肌细胞转录组数据进行分析及验证后,我们发现MYL2、CSRP3、BMP10、TBX5、TBX20、CXCL12、TNF及SERPINE1基因的表达下调可能参与到心肌细胞的增殖及迁移等生物学功能中,并最终造成TOF的发生。4.BMP10的异常表达可通过调控下游Smad1/5及MAPK信号通路从而影响心肌细胞的增殖功能。此外,在TOF的发生中,BX5及TBX20可能是BMP10的下游调控的转录因子。