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研究目的:骨骼肌钝挫伤发生后,受损骨骼肌除了发生经典的血管反应、炎症反应外,其内部还会形成缺氧环境,这种环境形成后可能引起线粒体功能降低,导致ATP产生不足,最终势必会使损伤的恢复时程延长,功能恢复不完全,甚至丧失正常解剖结构,预后较差。现有研究已证实,线粒体自噬是维持线粒体质量的重要力量,也是机体对代谢改变做出的一种重要的代偿性反应,该过程可及时清除损伤、功能障碍的线粒体,从而减少ROS的生成,而过多的ROS会直接损害健康线粒体,那么及时清除破损线粒体就可以防止损伤范围扩大。根据上述依据提出假设:1.损伤后骨骼肌超微结构发生改变:线粒体形态改变、完整性缺失,可见到线粒体自噬体的存在;2.钝挫伤发生后在骨骼肌恢复过程中ROS水平增高,线粒体功能下降;3.在观察骨骼肌钝挫伤恢复时程内,线粒体自噬被诱导且在损伤早期最为显著,而线粒体功能下降也发生在这一时期。本研究用重物砸伤动物骨骼肌制作动物模型,模拟运动中的骨骼肌钝挫伤,使用透射电镜观察线粒体自噬体及数量、检测受损组织中ROS生成量、对比线粒体呼吸链酶复合体活性及线粒体自噬相关指标的时程性变化等,通过这些指标的变化来观测和评价钝挫伤发生后线粒体自噬、线粒体功能的改变,从一个崭新视角来观察、解释骨骼肌钝挫伤发生、恢复的可能机制,并推测该过程中诱导线粒体自噬发生可能因素,希望可以为今后骨骼肌钝挫伤的临床治疗、康复、预防提供更多的理论支持。研究方法:随机选取64只雄性Wistar大鼠,分为8组:正常对照组以及钝挫伤后12h、2d、5d、7d、10d、15d、30d取材组(h:小时;d:天),每组8只。除对照组外其他各组用重物砸伤造模后按各组所示时间点取材,检测腓肠肌AMPKα2、HIF-1α、NIX、BNIP3蛋白、m RNA表达的变化;用透射电镜观察钝挫伤后骨骼肌超微结构的变化,观察是否存在自噬体及其自噬体数量的时程性改变;检测ROS、线粒体跨膜电位(ΔΨm)、电子传递链酶复合体CⅠ-Ⅳ、ATP合成酶等体现线粒体功能指标的时程性改变。通过检测损伤发生后上述各指标的变化情况,分析该过程中线粒体功能的改变,以及是否在该过程中发生了线粒体自噬,并推断线粒体自噬发生机制、可能产生的代偿后果;线粒体功能是否被损害,推测钝挫伤损伤线粒体功能降低的可能机制及可能产生的后果。研究结果:1透射电镜下观察骨骼肌超微结构在骨骼肌钝挫伤发生后时程性改变:从损伤发生直至伤后30天,均能观察到被双层膜包裹、半包裹的线粒体,伤后10天内更易观察到线粒体自噬体。2代谢相关蛋白AMPKα2、缺氧相关因子HIF-1α在损伤初期都有显著的升高(p<0.05),随着时间推移,二者表达从伤后5-7d就基本回落到正常水平,直至伤后30d。就二者m RNA表现来看,只有HIF-1α蛋白表达与其m RNA表达不一致。3线粒体自噬相关蛋白BNIP3、NIX表达水平在伤后12h-5d升高明显(p<0.05)HIF-1α表达与二者表现基本接近。此外,在二者水平增高组,电镜下可观察到较多数量被溶酶体包裹的线粒体。4钝挫伤后ΔΨm呈现明显的时程性改变:在损伤早期(12h、2d、5d)ΔΨm显著下降(p<0.05),该指标改变同BNIP3、NIX表达增高所在时间段基本吻合。5损伤后12h-5d各组ROS与对照组相比均有升高,且差异显著(p<0.05)。6损伤后12h-5d,线粒体电子传递链酶复合体C1、CⅢ活性升高,与对照组相比差异显著(p<0.05),这也同ROS水平的升高发生在相同时间段,而另外两个酶复合体活性并未发生显著变化。ATP合成酶的活性在损伤早期下降明显(p<0.05),从伤后7d开始逐渐回升至正常水平并保持到伤后30d。结论:1高浓度的ROS可直接攻击线粒体呼吸链造成线粒体损伤,而产生内源性ROS的部位又恰好是在线粒体电子传递链上。ROS升高的阶段与CⅠ、CⅢ活性升高的时间段基本一致,这说明线粒体电子传递链通过影响CⅠ、CⅢ活性直接对缺氧产生反应,CⅠ、CⅢ又是ROS产生的主要部位,故该阶段受损线粒体产生大量ROS,而体内的ROS清除系统无法及时清除过多的ROS。2代谢调节关键因子AMPKα2、缺氧相关因子HIF-1α均在线粒体功能变化期间出现高表达,该阶段更易观察到线粒体自噬体,这说明二者可能从对合成分解代谢的调整和线粒体质量控制方面做出代偿性调节。3线粒体自噬相关蛋白BNIP3、NIX在线粒体功能下降期间出现明显的高表达,同时透射电镜观察结果显示该阶段受损骨骼肌也存在许多被溶酶体全包裹或半包裹的线粒体。这说明在损伤后线粒体功能下降期间发生了线粒体自噬,且参与了机体的调整过程,通过对受损线粒体的清除,达到减少ROS的产生的目的,防止损伤范围扩大。虽然过度的线粒体自噬会引起细胞的凋亡,但就本实验来看,伤侧肢体功能是逐渐恢复的,且并未出现骨骼肌的坏死,说明线粒体自噬程度并未过度,作用是积极的。4正常线粒体跨膜电位(ΔΨm)的维持,是线粒体能否维持功能的关键,该指标的变化也是发生线粒体自噬和细胞凋亡的重要条件。在钝挫伤骨骼肌恢复过程中,ΔΨm表现出明显的时程性改变。在损伤早期(12h、2d、5d)ΔΨm显著下降,该结果结合BNIP3、NIX表达及电镜观察结果来推测,损伤后线粒体自噬被诱导,同时对比线粒体功能下降时间段推测线粒体自噬参与到损伤后的代偿机制中。