论文部分内容阅读
关节软骨类疾病作为一类严重影响动物及人类健康的疾病,成为当今医学、科学及社会普遍关注的问题。这类疾病的发生发展主要是由于各种致病因子作用于机体,导致软骨组织损伤所致,但因为关节部位的特殊解剖学结构,使得当前预防和治疗该病较为棘手。淫羊藿甙作为淫羊藿的主要单体之一,现代科学研究发现其能够通过激活细胞MAPKs通路而促进成骨细胞及软骨细胞的增殖、分化,抑制细胞凋亡,从而对骨损伤具有着明显的改善作用。但淫羊藿甙对关节软骨细胞的作用及作用机制尚完全清楚,因此本试验借助细胞培养、组织学、免疫组织化学、流式细胞仪等技术来研究淫羊藿甙对关节软骨细胞增殖、凋亡及NO/NOS、MMP-13分泌的影响。同时运用Western-Blot技术探究淫羊藿甙对关节软骨细胞MAPKs通路的作用及调控机理,从而为临床应用淫羊藿甙防治软骨细胞类疾病提供相应的科学依据。本试验以健康猪的膝关节为材料,利用酶消化法分离培养了猪的关节软骨细胞,建立了猪关节软骨细胞的高效体外培养方法。同时利用细胞学、HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化及超微结构观察等方法对分离培养的细胞进行了鉴定,发现采用酶消化法分离培养的细胞长势良好,形态、密度正常,可用于本试验的研究工作。MTT法检测淫羊藿甙对关节软骨细胞的作用发现：终浓度为1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL和40ng/mL的淫羊藿甙对关节软骨细胞的增殖均有促进作用。但随着培养时间的增加(1d、3d、5d、7d),各浓度淫羊藿甙对细胞增殖的促进作用也有所变化：低、中浓度淫羊藿甙的促进作用越来越显著(P<0.05),而高浓度的促进作用较之下降。在关节软骨细胞整个生长曲线上,浓度为10ng/mL的淫羊藿甙对其增殖有较好的促进作用,因此本试验就以终浓度为10ng/mL的淫羊藿甙作为对关节软骨细胞的最适浓度进行后续研究。终浓度为10ng/mL的淫羊藿甙作用于关节软骨细胞,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的结果显示：作用1d时可引起细胞G1期阻滞(P<0.05),但加入淫羊藿甙3d、5d、7d的细胞,周期无明显变化(P>0.05)；而淫羊藿甙对关节软骨细胞的凋亡无明显作用(P>0.05),因此认为淫羊藿甙有利于关节软骨细胞的生长增殖。利用比色法检测NO/NOS的结果发现：关节软骨细胞在终浓度为10ng/mL的淫羊藿甙作用5d时,NO和NOS的分泌显著减少(P<0.05)；利用ELISA方法检测MMP-13发现：作用3d、5d、7d时关节软骨细胞分泌MMP-13显著下降(P<0.05),由此表明淫羊藿甙可以明显调节关节软骨细胞多种分解因子的分泌。Westem-blot试验结果发现：终浓度为10ng/mL的淫羊藿甙加入关节软骨细胞培养1d、3d、5d、7d,各试验组分别在培养时间结束前5min、25min、1.5h加入淫羊藿甙后ERK1/2通路磷酸化蛋白水平无显著差异(P>0.05),但在5min和25min时试验组的ERK1/2通路磷酸化蛋白水平显著高于对照组(P<0.05),说明淫羊藿甙加入1d～7d ERK1/2通路磷酸化蛋白的表达无明显变化,且可以在短时间之内(5min)快速激活通路并维持通路的激活状态达1.5h。此外淫羊藿甙对p38通路的激活作用不如激活ERKl/2通路快速,25min后才达到激活高峰,且维持时间也较短,1.5h磷酸化蛋白表达水平已显著低于25min的表达水平(P<0.01)。因此认为淫羊藿甙作用于关节软骨细胞时能在短时间内激活MAPKs通路并维持其激活状态,且对ERK1/2通路的激活速度要快于对p38通路。根据以上试验结果可以得出结论：利用酶消化法可以得到良好的体外关节软骨细胞培养模型,终浓度为10ng/mL的淫羊藿甙对体外培养的关节软骨细胞具有良好的促增殖作用,且淫羊藿甙在作用于关节软骨细胞后短时间内激活MAPKs通路并维持其激活状态,从而减少关节软骨细胞分泌的NO/NOS和MMP-13,调节关节软骨细胞的增殖,表现出了对关节软骨细胞明显的改善作用。