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由鲤疱疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2）感染养殖鲫引起的鲫造血器官坏死病,给鲫养殖业造成了严重的经济损失。鲫造血器官坏死病发病迅速,在全世界广泛流传,致死率高,已严重制约鲫养殖业的健康发展。目前,围绕该病的机理研究与防治措施等方面的研究受到广泛关注。本研究:1)比较了 20株来源于江苏省和湖北省鲫养殖场分离株的CyHV-2 ORF25B 5’端基因及其3’端非编码区基因的变异情况;2)利用TMHMM Serverv.2.0、SignaIP 5.0、DNA Star 7.0（Protean）等生物信息学软件对CyHV-2 ORF25B基因序列进行综合分析,选取CyHV-2 ORF25B富含抗原表位的区域进行原核截短表达,制备了抗CyHV-2 ORF25B蛋白的多克隆抗体,通过免疫保护力测定实验研究了该蛋白的免疫原性;3)采用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒载体系统表达了 CyHV-2 ORF25B基因,将该质粒转染SF9细胞后测定该病毒滴度,利用SDS-PAGE和Western blot检测重组蛋白的表达情况,通过免疫保护力等实验研究了重组杆状病毒的免疫原性;4)采用酵母双杂交技术最终成功初步筛选出CyHV-2 ORF25B编码基因与鲫脑组织细胞互作的受体蛋白。具体研究内容如下:1.20株来源于江苏省和湖北省的CyHV-2 ORF25B部分编码基因序列和3’端非编码区基因序列的比较分析20株来源于江苏省和湖北省鲫养殖场的CyHV-2的ORF25B部分基因和3’端非编码区基因序列比较发现,实验室分离的20株CyHV-2 ORF25B编码区中变异区间的基因序列与SY-C1株和YZ-01株ORF25B编码区中变异区间的基因序列高度相似,仅有少量基因缺失,氨基酸序列的相似性在95.4-100%之间。对ORF25B 3’端非编码区变异区间的基因序列对比发现,3株实验室分离株与ST-J1株的基因序列的相似性为99.1-100%,而与其他毒株基因序列的相似性在67.6-71.3%之间。剩余的17株实验室分离株与SY-C1株、YZ-01株、1301株和SY株基因序列的相似性在97.2-100%之间。结合CyHV-2 ORF25B基因和3’端非编码区基因比较结果分析,引起江苏和湖北两省养殖鲫患病的CyHV-2主要为SY-C1株和YZ-01株。2.原核表达CyHV-2 ORF25B编码蛋白诱导的免疫原性利用生物信息软件选取CyHV-2 ORF25B富含抗原表位的区域截短,用原核表达系统表达了重组蛋白pET-JDORF25B,其分子量大小约53 kDa,符合预期结果。将重组蛋白pET-JDORF25B进行纯化后数次免疫大耳兔,制备了抗ORF25B的多克隆抗体,Western blot结果显示,该抗体能与pET-JDORF25B重组蛋白发生特异性识别。通过间接免疫荧光实验表明,GiCB细胞感染CyHV-2后,制备的多抗能与之特异性结合。免疫攻毒实验显示,免疫了纯化的pET-JDORF25B重组蛋白的鲫鱼的相对存活率为38%。3.杆状病毒表达载体系统表达CyHV-2 ORF25B截短蛋白的特性研究及其免疫应答以提取的CyHV-2鲫鱼阳性组织病毒核酸为模板,设计特异性引物JD25B-Bac-F/R进行PCR扩增,将扩增的PCR产物连接到杆状病毒表达载体pFastB ac1后,转化至大肠杆菌DH10Bac中,构建了重组穿梭质粒Bacmid-JD25B。借助脂质体Cellfection TM Ⅱ将重组质粒Bacmid-JD25B转入SF9细胞中,获得了滴度较高的P1代重组杆状病毒,收毒将病毒接至P3代后,测得其病毒滴度TCID50为10-7.04/0.1 mL。将病毒扩大培养后,利用SDS-PAGE进行分析蛋白分子量,在36 kDa处出现一条特异性条带,且用Ni柱进行亲和纯化,获得单一条带,说明其纯化效果较好。将制备的原核pET-JDORF25B多克隆抗体与利用杆状病毒系统表达的Bacmid-JD25B孵育进行Western blot验证,显示在大小约为36 kDa处有特异性目的条带,表明重组蛋白Bacmid-JD25B在SF9细胞中能成功表达,且能与制备的多克隆抗体发生特异性结合。将纯化后的Bacmid-JD25B重组蛋白免疫银鲫后,攻毒CyHV-2,其相对存活率为54%,表明杆状病毒表达的Bacmid-JD25B重组蛋白免疫原性较好,较高于原核表达的pET-JDORF25B重组蛋白的相对存活率（38%）。4.GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库的多态性检测将实验室保藏的酵母双杂交GiCB cDNA文库复苏后,测得滴度为1.92×106 CFU/mL。挑取单菌落提取酵母质粒,进行PCR扩增,结果显示产物条带大小上下交错,且大多数在1.0 kb以上,证明文库具有良好的多态性,可用于下步双杂交实验。5.CyHV-2 ORF25B诱饵载体的构建及其与细胞相互作用受体蛋白的筛选以从患病鲫鱼体内提取的CyHV-2为阳性模板扩增出tORF25B基因序列,将扩增产物连接到诱饵载体pGBKT7上,构建重组质粒pGBKT7-tORF25B。并将其转化至酵母菌Y2H Gold,获得了诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2H Gold。在营养缺陷型培养基上,证明了诱饵表达载体pGBKT7-tORF25B对酵母菌Y2H Gold无毒性作用,也不会出现自激活现象。利用酵母双杂交技术,将诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2H Gold与鲫脑组织细胞系（GiCB）cDNA文库杂交,初步筛选出4种与tORF25B基因编码蛋白互作的宿主蛋白。综上所述,本研究比较分析了 20株来源于江苏和湖北省分离株CyHV-2 ORF25B 5’端基因及其3’端非编码区基因的变异情况,证明了 CyHV-2 ORF25B基因免疫原性较好,初步成功筛选到CyHV-2 ORF25B基因的鲫鱼脑组织细胞系受体蛋白。本研究结果为深入开展CyHV-2编码蛋白功能及病毒入侵宿主细胞的机制研究提供了重要理论支撑,同时也为抗CyHV-2药物和亚单位疫苗的研发奠定了科学依据。