研究背景多器官功能障碍综合症(MODS)是引起严重烧伤患者死亡的主要原因之一。虽然引起MODS的病理生理过程纷繁复杂,但随着研究的深入人们逐渐达成共识,血管内皮细胞的功能紊乱是这一病理生理过程的中心环节。而在严重烧伤早期,血管内皮细胞的功能紊乱主要表现为烧伤后内皮细胞“毛细血管渗漏”及随之而来的间质水肿。危重病患者时常伴有胰岛素抵抗和高血糖,而这种“创伤后胰岛素抵抗”的严重程度往往反映了这些危重病患者(如严重创伤、严重烧伤及脓毒症)的死亡风险。在一个外科重症监护病房的前瞻性研究中,人们发现强化胰岛素治疗来严格控制血糖水平可明显减少严重感染、器官衰竭以及死亡率。在关于其机制的探讨中,一些研究人员认为代谢调节机制是强化胰岛素治疗的唯一作用途径。然而,近年来人们逐渐发现胰岛素还具有抗炎、抗凋亡、促细胞增殖以及调节机体免疫功能的特性。也就是说胰岛素除了具有代谢调节特性外还具有非代谢作用机制。近期又有研究报道强化胰岛素治疗具有内皮细胞保护作用并认为其可能是阻止危重病患者多脏器衰竭和死亡的重要机制。但到目前为止,危重病患者强化胰岛素治疗的确切机制仍不清楚。在本课题中,我们主要是探讨胰岛素对严重烧伤后内皮细胞功能紊乱的调节作用。首先,在体严重烧伤动物模型上,利用强化胰岛素处理观察其对急性肺损伤的作用。我们的设想是强化胰岛素处理是否可以通过对微血管内皮细胞的保护,防止微血管渗漏,从而达到减轻烧伤后肺组织水肿、出血及炎性细胞浸润的目的。在此基础上,我们进一步体外利用脐静脉血管内皮细胞,观察胰岛素干预后内皮细胞单分子通透性与细胞紧密连接以及凋亡的变化和内在联系,并就可能存在的细胞内信号传导机制进行相关研究。方法1.雄性SD大鼠75只,随机分成假烫组、烫伤组(30% TBSAⅢ○),烫伤+胰岛素处理组。氧化酶法测定烫伤后24小时内大鼠血糖变化。烫伤12小时后,HE染色观察肺脏病理变化,检测肺脏髓过氧化物酶(MPO)、血清超氧化物歧化酶(SOD)以及支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量变化。同时,电镜观察肺微血管内皮细胞变化,比色法检测各型一氧化氮合酶及血清一氧化氮(NO)水平。2.体外培养原代人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),随机分为空白对照组、20%(V/V)人正常血清刺激组、20%(V/V)人烧伤血清刺激组、20%(V/V)人烧伤血清+胰岛素处理组及抑制剂(LY-294002)组,利用生物素标记的BSA测定内皮细胞单分子通透性变化,罗丹明-鬼笔环肽标记细胞骨架并观察,同时利用蛋白印迹法检测带状闭合蛋白-1(ZO-1)、咬合蛋白及磷酸化蛋白激酶B(AKT)的变化情况。3.体外培养的原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC),随机被分为空白对照组、20%(V/V)人正常血清刺激组、20%(V/V)人烧伤血清刺激组、20%(V/V)人烧伤血清+胰岛素处理组,刺激6小时后运用原位末端标记(TUNEL)法观察内皮细胞凋亡,分别采用免疫组织化学染色法和(或)蛋白印迹法检测抗凋亡蛋白bcl-2及eNOS的蛋白表达情况。4.体外原代培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),随机被分为空白对照组、20%(V/V)正常人血清刺激组、20%(V/V)烧伤人血清刺激组、20%(V/V)烧伤人血清+胰岛素(10-7mol/L)处理组及抑制剂(LY-294002)组。ELISA法检测采集血清中IL-1β和TNF-α的水平。刺激6小时后,蛋白印迹法检测HUVEC胞浆抑制酶κB-α(IκB-α)和胞核NF-κB-p65的蛋白表达变化。结果1.强化胰岛素处理明显减轻烧伤后大鼠的肺组织水肿、出血及炎性细胞浸润。BALF中蛋白含量和肺组织MPO含量明显减少(P <0.05),而血清SOD增加明显(P <0.01)。肺微血管透射电镜下观察强化胰岛素处理组较单纯烫伤组内皮细胞受损程度明显改善。强化胰岛素处理组血清NO、血清总一氧化氮合酶(NOS)和结构型一氧化氮合酶(cNOS)含量较单纯烫伤组均明显增加(P <0.01)。2.体外实验中,内皮细胞单分子通透性在烧伤血清刺激下明显增加,胰岛素干预(10-7 mol/L)可阻断其损伤效应。同时观察发现,胰岛素干预(10-7 mol/L)后烧伤血清刺激引起的内皮细胞张力丝形成减少,ZO-1蛋白表达降低。应用AKT特异性阻断剂后在阻断了AKT磷酸化的同时胰岛素的上述保护效应也随之减弱或消失。3.与空白对照组比较,烧伤血清可明显促进内皮细胞凋亡,bcl-2和p-eNOS蛋白表达降低(P <0.01)。相对于单纯烧伤血清刺激组,胰岛素处理组(10-7 mol/L)细胞凋亡显著减少,bcl-2和p-eNOS蛋白表达明显恢复(P<0.01)。eNOS在各组中无明显变化。4.与空白对照组比较,烧伤血清诱导了HUVEC的损伤,胞浆p-IκB-α和胞核NF-κB-p65蛋白表达增多。相对于单纯烧伤血清刺激组,胰岛素处理组HUVEC损伤减轻,胞浆IκB-α的磷酸化和NF-κB-p65核移位明显减轻。AKT特异性抑制剂(LY294002)能够消除胰岛素对烧伤血清诱导HUVEC的NF-κB-p65核移位抑制作用。结论1.在体动物实验,强化胰岛素处理有效改善严重烧伤所致的急性肺损伤,其中胰岛素的血管内皮细胞保护作用可能发挥着关键的作用。2.体外细胞实验,胰岛素通过PI3K/AKT途径减轻烧伤血清刺激下的血管通透性增高。其中,内皮细胞细胞骨架重排及紧密连接相关蛋白的有效保护是其作用关键,这一机制的发现对烧伤后多脏器衰竭的防治意义重大。3.体外细胞实验,胰岛素可增加烧伤血清诱导下抗凋亡蛋白bcl-2的表达并抑制内皮细胞凋亡,此作用可能与eNOS的磷酸化密切有关。4.体外细胞实验,胰岛素通过调节PI3K/AKT信号通路抑制了胞浆IκB的磷酸化,继而限制NF-κB的核移位,参与了胰岛素对烧伤后内皮细胞功能紊乱的调控作用。