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苯丙酮尿症(Phenylketonuria,PKU,OMIM#261600)是一种最常见的常染色体隐性遗传代谢病,因苯丙氨酸轻化酶(Phenylalanine Hydroxylase,PAH)基因突变导致PAH活性降低或丧失,苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)在肝脏中代谢紊乱所致。PKU发病率有种族和地区差异,我国北方地区的PKU发病率高于南方地区,而西北地区明显高于全国平均水平,是PKU的高发区域。本论文对西北地区PKU患者的分子遗传基础进行了研究,分析了该地区PKU致病基因PAH的突变谱,明确了其突变热点以及突变位点与PKU临床表型的相关性,为PKU的防治奠定了基础数据。为了筛选西北地区PKU患者中PAH基因热点突变,建立了一种基于MassArray基因分型技术的PAH基因突变热点的筛查方案,评价其特异性和准确性。建立了一种基于微液滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)的苯丙酮尿症无创产前诊断的方法,并与常规侵入性诊断方法进行比对评价其准确性。通过本研究建立了一个集孕前或孕期PAH基因热点突变携带者筛查、孕期无创和侵入性产前诊断、产后基因诊断为一体的PKU三级预防干预方案。我们收集整理了西北地区475个PKU家系,采用Sanger测序、MLPA方法、gap-PCR对PAH基因突变进行分析,并采用生物信息学软件对新发现的突变进行功能预测,分析PAH基因突变与PKU患者表型的相关性。结果在475例PKU患者的950个等位基因中检测到895个突变,检出率为94.21%(95%CI,92.72%-95.70%),通过家系验证鉴定了 128个突变,突变等位基因中频率最高的是c.728G>A(14.00%)、其次是 c.611A>G(5.58%)、c.1068C>A(4.95%)。74 例患者采用 MLPA 方法鉴定了PAH基因7种大片段缺失/重复突变,占总突变频率的3.01%(27/895),其中c.-4163_-406del3758是西北地区最常见的类型,并用gap-PCR分析了大片段缺失突变的断裂点。我们鉴定了 20个PAH基因新突变,并对其功能进行了预测。根据PKU患者的临床分型标准将475例患者进行分型,并对患者的表型与基因突变频率进行相关性分析,结果提示c.158G>A、c.1256A>G与轻度高苯丙氨酸血症相关。为了筛选西北地区PAH基因突变频率位于前35位的突变位点,设计了基于MassArray技术的突变分型方案,成功对其中29个突变分两组反应进行了分型分析,设计成功率为82.85%。对105例已明确PAH基因突变的PKU患者样本进行MassArray分型,通过两个Panel的检测,29个突变均检测到了突变样本,MassArray基因突变分型结果均与Sanger测序结果一致,检测准确性为100%。采用双盲法对照实验,对初诊的50例苯丙酮尿症患者进行MassArray技术筛查热点突变,同时采用Sanger测序及MLPA分析进行突变验证,50例初诊的苯丙酮尿症患者中MassArray技术检测到74个突变等位基因,检出率为74%(95%CI,65%-83%),基因诊断率为 54%(95%CI,40%-68%)。我们收集了 24个需要进行产前诊断的PKU家系,先证者及父母基因突变明确,采用传统的侵入性产前诊断方法对胎儿进行了产前诊断,同时采集孕妇外周血10mL,分离孕妇血浆,提取血浆中cfDNA。侵入性产前诊断结果显示了在24例胎儿中3例为受累胎儿,8例为正常胎儿,13例为致病突变杂合携带者。针对产前诊断家系PAH基因突变特点设计基于微液滴数字PCR(ddPCR)检测方案,并对方案的灵敏度和特异性进行了评价。成功对其中8个家系进行无创产前诊断分析,无创产前结果与侵入性产前诊断的结果一致,未发现有假阳性也假阴性结果。本研究通过对475个西北地区PKU家系进行PAH基因突变研究,首次建立了西北地区苯丙酮尿症患者基因突变谱,明确了西北地区PAH基因热点突变区域及突变的分布特点。首次发现并鉴定了 20个PAH基因新的变异位点,并对这些位点进行了功能分析,丰富了PAH基因突变库。通过基因型表型分析明确了部分突变位点与表型的相关性,此结果可以为表型预测提供一定的依据。根据西北地区PAH基因突变热点分析建立了一种基于MassArray技术的PAH基因热点突变检测方法,该方案可以同时对PAH基因29个热点突变位点进行基因分型,突变检出率可达到74%(95%CI,65%-83%),该检测技术操作简单,具有高准确性和特异性,可以作为一种高通量、低成本、快速的PAH基因突变筛查和诊断的方法。本研究首次建立了一种基于ddPCR方法的PKU无创产前诊断方案,并进行了系统的评价,结果显示ddPCR在cfDNA检测方面均有高的灵敏度和特异性,是一种可靠的PKU的无创产前诊断方法。