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CD4+CD25+调节性T细胞(Regulatory T Cells, Tregs)是天然产生的调节性T细胞的重要亚群之一,在调控免疫系统和维持外周耐受方面起着重要作用。研究表明：CD4+CD25+调节性T细胞是免疫反应的一种主要负调控细胞,能有效地抑制自身免疫性疾病、过敏反应以及同种异基因移植后的排斥反应。而且基于CD4+CD25+调节性T细胞输注的相关免疫治疗可能成为许多免疫失调疾病有效的治疗方法。这种治疗方法已经在造血干细胞移植、器官移植以及自身免疫性疾病动物模型中得以证实。然而,机体内天然的CD4+CD25+调节性T细胞数目很少。在人体内,CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的5%～10%,而小鼠的只占1%～2%。这就需要建立有效的CD4+CD25+调节性T细胞体外扩增方法,才能满足大量的临床输注需求。本研究采用免疫磁珠分离纯化人外周血的CD4+CD25+Treg细胞,采用IL-2和Anti-CD3/CD28单克隆抗体在体外扩增Treg细胞,通过流式细胞术和CD4+CD25-效应T细胞增殖抑制实验检测扩增后Treg细胞表型和功能。此外,为了探讨雷帕霉素(rapamycin, RAPA)对人CD4+CD25+调节性T细胞体外扩增的影响,在采用IL-2和Anti-CD3/CD28单克隆抗体体外扩增Treg细胞的基础上,还将本实验分为3组,第一组在CD4+CD25+Treg培养体系中不加雷帕霉素(rapamycin, RAPA),共培养两轮各6天,中间第8天去除包被CD3/CD28单克隆抗体的免疫磁珠,让CD4+CD25+Treg细胞处于休息状态,第10天重新刺激继续第二轮培养；第二组培养体系中除加入100nmol/L RAPA以外,第一轮培养时间为10天,同上中间休息2天,第12天重新刺激继续第二轮培养,其它条件与第一组相同;第三组是CD4+CD25+Treg细胞培养第10天同上休息2天,第12天重新刺激时先将细胞进一步分选得到CD4+CD25+CD127-Treg细胞后再继续培养,培养体系与第二组相同。实验结果表明,MACS分选纯化得到的CD4+CD25+Treg细胞和CD4+CD25-T细胞,通过流式细胞仪双荧光检测,细胞纯度分别达到91%和98%。加RAPA培养的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞扩增倍数比不加RAPA的低(1.0×103vs.1.8×103),但细胞的纯度明显提高(92%vs.80%)。而加RAPA培养的第二、三组CD4+CD25+Treg细胞在纯度上没有明显的差异。加RAPA培养的CD4+CD25+Treg细胞扩增后保持其无能状态。体外抑制实验显示体外扩增的CD4+CD25+Treg细胞对CD4+效应T细胞增殖均有明显的抑制作用,而且加RAPA扩增的Treg细胞表现出更强的抑制功能。另外,与第一组体外扩增的Treg细胞相比,加RAPA扩增的Treg细胞表达低水平的IL-2和IFN-γ。实验结果表明：雷帕霉素抑制了CD4+CD25+Treg细胞中混杂的CD4+效应T细胞的扩增,因此使用雷帕霉素大大提高了体外扩增CD4+CD25+Treg细胞的纯度以及免疫抑制功能。最后,本文还初步探讨了体外扩增CD4+CD25+Treg细胞的细胞冻存与复苏方法,这将为体外扩增CD4+CD25+Treg细胞应用于临床提供实验依据。