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福提霉素是一类以福提霉胺为糖苷取代基,具有新颖的拟二糖结构的氨基糖苷类抗生素。福提霉素生物合成途径与各个基因的关系,至今未被阐明,而国内关于福提霉素高产菌株选育的研究仍停留在传统的筛选与原生质体制备阶段,对于该药物生物合成基因功能的研究,尚属空白。本研究采用框内敲除基因的方法,定向失活目的基因,阐明关键基因的功能,分析基因缺失对次级代谢产物的影响,以推测糖基修饰基因的作用及其修饰位点,为基因育种奠定基础。橄榄星小单孢菌接合转移体系的建立:通过敏感性试验确定阿泊拉霉素抗性基因aac(3)Ⅳ为抗性筛选标记。以质粒pJTU412为穿梭载体,插入aac(3)Ⅳ,构建敲除基因forQ重组质粒pUQ502,转化E.coli ET12567(pUZ8002)作为供体菌。孢子经50℃热激15 min后32℃预萌发60h,按108:109比例与供体菌混合,涂布于橄榄星小单孢菌培养基上,48h后覆盖抗生素,阿泊拉霉素浓度为25μg/mL,萘啶酸浓度为25μg/mL。一、forQ基因功能的研究。通过接合转移将构建好的重组质粒pUQ502导入橄榄星小单孢菌FOM868得到单交换菌株QD1,经松弛培养和影印平板筛选,最终得到敲除forQ基因工程菌FQ61。发酵提取代谢产物,采用TLC和MS检测分析,与出发菌株FOM868比较,工程菌FQ61不再合成福提霉素A和B,而积累中间代谢产物FTM-AO。表明forQ基因参与福提霉素生物合成途径中绛红糖胺C-6’位的脱氢作用。二、forO基因功能的研究。以温敏型质粒pKC1139为载体,构建重组质粒pOB32,通过接合转移导入橄榄星小单孢菌FOM868,经筛选获得forO基因缺失突变株F05。发酵结果显示,F05不再合成福提霉素A和B,生成福提霉素中间产物,福提霉素O-CH3的合成受阻,结合生物信息学分析,认为forO与福提霉素生物合成中氧甲基化的合成有关。三、forK基因功能的研究。采用与研究forO相似的研究方案,获得forK基因缺失工程菌FK6。经发酵提取代谢产物,通过MS检测分析,结果显示FK6的福提霉素生物合成代谢流被阻断,生成福提霉素中间代谢产物,福提霉素中绛红糖胺C-6’位的甲基化的转变合成受阻,提示forK是参与福提霉素生物合成过程甲基化反应的关键基因。四、糖基修饰基因sisI与genP基因组合的研究。以pKC1139作为克隆载体,构建sisI替换genP的重组质粒pIP303,导入绛红小单孢菌G1008基因组,筛选获得基因重组工程菌GIP95。借助TLC、HPLC和MS检测分析,突变株GIP95的代谢流未被阻断,仍能合成庆大霉素C族组分。由此得出结论,外源基因依纽小单孢菌3’,4’-双脱羟基基因sisI参与了庆大霉素生物合成中绛红糖胺3’,4’-双脱羟基作用,在绛红小单孢菌G1008中实现了基因异源表达。