论文部分内容阅读
肠外致病性大肠杆菌(Ex PEC)是一种人兽共患病原菌,根据报道表明,其感染范围远远大于其他已知的大肠杆菌,所以造成巨大损失。临床数据统计表明,ExPEC是一种非常重要致中枢神经系统(CNS)感染病原菌。中枢神经系统(CNS)是机体中密封的组织器官。通常病原微生物感染CNS的方式,主要是通过两种途径:第一种是通过感染邻近组织继而向颅内扩散,第二种是通过血源感染,后续穿透血脑屏障造成CNS感染。其中,病原微生物穿过血脑屏障造成感染是最常见的一种形式。脑膜炎是最常见的一种CNS感染,病原微生物通过粘附血管内皮细胞进行刺激,并且促使中性白细胞进入CNS,从而来引发炎性进程。内皮细胞表面存在丰富的小窝(caveolae),这是一种呈凹陷状的细胞膜表面结构,在信号传导和内吞中都发挥巨大作用。其主要成分是小窝蛋白(caveolins)和胆固醇。胆固醇是小窝结构的含量最高的组成分,小窝蛋白-1(caveolin-1)是内皮细胞中小窝最主要的功能蛋白,并且这两种组分对于小窝结构和功能的维持都是必要的。通过一系列体外实验,结果发现caveolin-1与不饱和长链脂肪酸具有高度亲和力,这也表明caveolin-1可能参与小窝中胆固醇的运输。然而,胆固醇和caveolin-1在ExPEC突破宿主血脑屏障,继而引发机体CNS感染中的作用并不清楚。本实验通过猪源肠外致病性大肠杆菌菌株PCN033作为研究对象,采用HBMECs模拟血脑屏障(BBB)体外模型,通过检测caveolin-1在感染前后的转录和翻译变化水平和相关信号通路验证,结果表明,caveolae在PCN033入侵中具有重要作用。这也为研究新的抗ExPEC感染提供新的靶点和理论基础。取得结果如下:1.Caveolae存在于脑微血管内皮细胞(BMEC)表面Caveolin-1是caveolae的标志性蛋白,本实验通过提取HBMEC细胞的RNA并反转录,采用PCR检测感染前后的caveolin-1、caveolin-2、caveolin-3基因,检测结果显示HBMEC中转录caveolin-1和caveolin-2。同时提取不同感染时间的HBMEC细胞总蛋白,检测caveolin-1和caveolin-2蛋白变化及磷酸化。结果显示:在HBMEC中存在caveolin中caveolin-1和caveolin-2两种形式,并且,在细胞受到感染后主要通过caveolin-1的磷酸化发挥功能。2.Caveolae在内皮功能中的作用内皮细胞表面存在丰富的caveolae结构。本研究通过研究在血源性细菌感染中,使用caveolae的抑制剂是否会影响ExPEC侵入脑组织能力变化,和干扰以及过表达caveolin-1后ExPEC入侵HBMEC能力变化,从而探讨caveolae在其中的作用。结果表明:在使用caveolae抑制剂之后,ExPEC入侵脑组织能力相应也有下降。同时,干扰caveolin-1后,Ex PEC入侵能力显著降低;过表达caveolin-1后,Ex PEC入侵能力显著升高。这说明,细菌能够通过caveolae介导的内吞穿过血管内皮细胞从而导致脑膜炎,并且caveolin-1在其中起重要作用。3.Caveolin的调节信号传导分子机制SREBP是胆固醇敏感器,在胞内胆固醇含量发生变化时会进行负反馈调节,通过裂解之后入核与SRE元件结合从而负反馈调节基因转录水平。但是对于SREBP在本实验中的作用形式仍是未知。本研究通过采用RT-PCR的方法检测HBMEC中SREBP三种形态转录水平变化,来探究其作用形式。结果表明:发挥主要功能的是SREBP-1a和SREBP-1c。并且在抑制SREBP激活之后,CAV-1的转录水平也有了极其显著的提高。