本研究是国家自然科学基金项目“加味茵陈四逆汤对胆道闭锁小鼠肝纤维化模型TGF-β1/smads通道及MMPs/TIMPs的影响研究”(课题编号：81373686)的部分研究内容。胆道闭锁是临床上新生儿胆汁淤积性黄疸的常见病因之一,本病最终会导致肝纤维化及肝硬化的发生。而目前相关文献报道TGF-β1/Smads信号传导途径的激活与否与肝纤维化的发生、发展及最终结局相关,是慢性肝脏炎症反应导致肝纤维化过程中起到关键的调节作用的通路。在肝脏炎症反应形成肝纤维化的微环境中,血小板和肝库普夫细胞等多种细胞均可以分泌细胞因子TGF-β,而在分泌TGF-β的细胞中,活化的肝星状细胞表达TGF-β较其余细胞明显升高,而肝星状细胞是形成细胞外基质的主要细胞,因此认为TGF-β在肝星状细胞生成细胞外基质的过程中作为正性的调节因子。而细胞因子TGF-β1是TGF-β家族中3种不同的亚型中明确的早期致纤维化细胞因子,其活化机制是TGF-β1与肝星状细胞TβR结合,激活细胞胞质内的Smads蛋白。因此,TGF-β1/Smads在肝脏炎症后形成肝纤维化过程中起着重要作用,该通道也是目前研究肝纤维化的一个热点,而中药可以有效的延缓肝纤维化的发生、发展,甚至可以有效逆转早期肝纤维化,因此,探讨中药延缓肝纤维的疗效机制有着重要的意义。对于胆道闭锁的治疗,目前认为Kasai术是有效的治疗手段,然而Kasai术并不能阻止肝纤维化的发生。对于术后肝纤维化防治,西医主要给予糖皮质激素及利胆的熊去氧胆酸治疗,临床上还缺少患者长期获益的证据,中医药对本病的防治研究起步较晚。本课题组在前期研究的基础上,对小儿胆道闭锁Kasai术后证候规律进行了研究,结果显示患儿具有阳虚、湿困、血瘀的特点,针对此病机特点,运用温阳化湿活血法,以加味茵陈四逆汤为基础方对小儿胆道闭锁Kasai术后进行治疗,在改善临床症状、延缓肝纤维化的发生、提高生存质量上取得一定疗效,但其作用机理尚不明确,而目前中药对防治胆道闭锁肝纤维化机制的研究尚未见报道。目的：基于临床研究的基础上,从TGF-β1/Smads信号通路方面,研究加味茵陈四逆汤对HSC-T6所致纤维化进程的影响,探索其可能的作用机制及治疗靶点,为中医药在防治小儿胆道闭锁Kasai术后肝纤维化中的运用提供依据。方法：1.收集中山大学第一附属医院和广州中医药大学第一附属医院的门诊及住院的胆道闭锁患儿,按照纳入标准及排除标准纳入观察病例,按照临床病例观察表要求填写加味茵陈四逆汤干预后患儿的临床症状改善情况,进行统计分析。2.CCK8检测加味茵陈四逆汤含药血清对TGF-β1干预的大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)活化增值的影响2.1含药血清的制备60只SD大鼠按随机数字表法分为3组：空白组,中药高剂量组,阳性药物组,药物给药剂量参照文献“药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算”,其中中药给予正常剂量的2倍制备高剂量含药血清,使用时采用空白血清稀释；空白组给予与中药相同体积的蒸馏水灌胃,阳性药物组给予正常剂量；连续3天,每天给予2次灌服,第4天晨给予1次剂量灌服,2h内腹主动脉取血,4℃,3000 r/min,离心30 min,将同组大鼠离心所得血清混合,56℃C水浴灭活30 min,最后用0.22 um的针头滤器过滤除菌,分装后-20℃保存备用。临用前用空白大鼠血清将中药血清稀释为中、低剂量使用；2.2细胞分组空白组(含10%正常大鼠血清-DMEM培养液5 m1)、模型组(含10%正常大鼠血清-DMEM培养液5 ml)、阳性药物组(含10%正常大鼠阳性药血清-DMEM培养液5 ml)加味茵陈四逆汤大鼠血清高剂量组(含10%大鼠高剂量血清-DMEM培养液5 ml)、中剂量组(含10%大鼠中剂量血清-DMEM培养液5 ml)、低剂量组(含10%大鼠低剂量血清-DMEM培养液5 m)、除正常组外,其余各组分别加入TGF-β1(终浓度10 g/L),将各组细胞置于5%C02培养箱培养；2.3 CCK8法检测吸光度将细胞数按5000个/ml接种至96孔板,每孔100ul,均设5个复孔；分别于培养箱中培养48、72小时后每孔加入lOul CCK8,继续培养半小时后酶标仪检测450nm处测定吸光度A值,结果以5个复孔A的均值表示。3. RT-PCR检测含药血清对TGF-β1干预的大鼠肝星状细胞株(HSC-T6) TβR1 Smad3、Smad7、collagen Ⅰ、 collagenⅢmRNA的表达3.1含药血清的制备同2.1及细胞的分组同2.2；3.2将空白组、模型组、阳性药物组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组细胞置于5%C02培养箱培养48 h(细胞数＞1×105/ml).培养结束后用PBS清洗3遍,弃去PBS,用处理过的细胞刮刀刮取细胞,并转移至1.5mlEP管中,4000r/min 4℃ 3 min离心弃上清。采用RT-PCR检测TβR1、Smad3、Smad7、collagen Ⅰ、 collagenⅢmRNA的表达,以β-action为内参照,2-ΔΔCt计算各基因表达进行分析。4. Western blot检测加味茵陈四逆汤含药血清对TGF-β1干预的大鼠肝形状细胞株(HSC-T6)TβR1、Smad3、Smad7、collagen Ⅰ、collagenⅢ蛋白的表达4.1含药血清的制备同2.1及细胞的分组同2.2；4.2将空白组、模型组、阳性药物组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组细胞置于5%C02培养箱培养48 h(细胞数>1x105/m1)。培养结束后用PBS清洗3遍,弃去PBS,用处理过的细胞刮刀刮取细胞,并转移至1.5ml EP管中,4000 r/min 4℃ 3 min离心弃上清。采用Western blot检测TβR1、Smad3、Smad7、collagen Ⅰ、 collagenⅢ蛋白的表达,以β-action为内参照,以相应蛋白灰度结果与β-action的比值作为相对表达量进行统计分析。结果：1.加味茵陈四逆汤可以有效改善患儿的黄疸程度、精神状态、腹胀程度、呕吐症状、食量、大便的颜色性状以及患儿肝脾肿大体征,在一定程度改善了患儿生活质量,且本研究也显示加味茵陈四逆汤可有效改善患儿的肝功能及肝纤维化六项等实验室指标。2.给予外源性刺激因子TGF-β1(10ng/ml)刺激,在48小时后中药各剂量组含药血清与空白血清相比均可抑制细胞的增殖(P<0.05),72h时后中药各剂量含药血清对细胞的增值与空白血清相比无明显影响(P>0.05)；3.①TGF-β1诱导的HSC-T6细胞模型组Tβ R1 mRNA表达与空白组相比无显著差异(P>0.05),阳性药物组和加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组与模型组相比无显著差异(P>0.05)；②TGF-β1诱导的HSC细胞模型组smad3 mRNA表达与空白组相比有显著差异(P<0.05),加味茵陈四逆汤中剂量组与模型组相比有显著差异(P<0.05)；③TGF-β1诱导的HSC细胞模型组smad7 mRNA表达与空白组相比无显著差异(P>0.05),加味茵陈四逆汤各剂量组与模型组相比无显著差异(P>0.05)；④DTGF-β1诱导的HSC细胞模型组collagen Ⅰ mRNA表达与空白组相比有显著差异(P<0.05),加味茵陈四逆汤中剂量组与模型组相比有显著差异(P<0.05)；⑤DTGF-β1诱导的HSC细胞模型组collagenⅢ mRNA表达与空白组相比有显著差异(P<0.05),加味茵陈四逆汤高剂量组与模型组相比有显著差异(P<0.05)。4.①Western blot检测TβR1蛋白相对表达量结果：TβR1多重比较“空白组”与“模型组”,“中药低剂量组”与“模型组”之间的差异有统计学意义(P<0.05)；②western blot检测Smad3蛋白相对表达量结果：Smad3相对表达量结果Smad3多重比较分析“中药低剂量组”与“模型组”差异有统计学意义(P<0.05)；③Smad7蛋白相对表达量结果：Smad7多重比较各组间的差异无统计学意义(P>0.05)；④collagen Ⅰ蛋白相对表达量结果：collagen Ⅰ多重比较分析“模型组”与各组间的差异无统计学意义(P>0.05)；⑤collagenⅢ相对表达量结果：collagenⅢ多重比较分析“模型组”与“空白组”、“阳性药物组”、“中药中剂量组”之间的差异有统计学意义(P<0.05)。结论：综上相关的临床及离体实验研究结果表明,加味茵陈四逆汤延缓肝纤维化的发生、发展及改善患儿生存质量方面的机制可能通过TGF β1/Smads信号通路起作用。在本次离体实验研究中,基因表达方面：加味茵陈四逆汤含药血清与模型组相比较可以显著降低smad3 mRNA、collagen Ⅰ mRNA、collagenⅢ mRNA的表达,虽然在统计学上TβR1 mRNA与模型组相比较无明显差异,但在数值上较模型组降低明显；在蛋白表达方面：加味茵陈四逆汤含药血清可以显著降低TβR1、Smad3、collagenⅢ蛋白的表达。提示加味茵陈四逆汤改善肝纤维化的机制可能是通过下调TGFβ1/Smads信号通路中的起正性调节作用的TβR1、Smad3蛋白起作用,最终降低胶原蛋白的表达。然而,本次研究中起抑制作用的Smad7其基因和蛋白均未见明显的改变,与理论上有一定的差别,这可能提示本药的治疗作用还有其他机制的参与,这在一定程度上也体现了中医药多靶点,多层次的作用特点,也需要我们进一步研究提供思路。