传染性支气管炎病毒IBV(Infectious Bronchitis Virus,IBV)可引起鸡急性高度接触性呼吸道疾病。IBV具有易突变的特性,其中弱毒疫苗可能又会有散毒的风险,这些对于将来IBV疾病的净化带来很大的挑战,所以弱毒疫苗必将随着技术的发展而淘汰。因此,建立基于IBV非结构蛋白的ELISA抗体检测方法对于了解鸡群中传染性支气管炎IB(Infectious Bronchitis,IB)的流行情况、适时调整免疫程序,有效防制IB以及将来对IBV的疾病净化提供一种有效的检测方法。5b蛋白是IBV的非结构蛋白,结构和功能均保守,且不参与病毒粒子的组成,本研究针对5b蛋白制备了鸡多克隆抗体,建立了检测IBV的间接ELISA方法,同时以非结构蛋白5b作为检测抗原具有区分灭活疫苗免疫和活毒感染的潜力。本研究以pET-32a(+)为载体,构建表达5b蛋白片段的重组表达质粒,转化感受态细胞并诱导表达,以及纯化。将纯化后的5b蛋白作为免疫原,免疫4周龄SPF(Specific Pathogen Free,SPF)鸡,四免后采集血清并保存,进一步用Western Blot鉴定,结果表明获得的多抗可与5b蛋白特异结合。IBV 5b-ELISA确定的最佳反应条件:抗原包被浓度为5μg/mL,待检血清稀释倍数为1:400,酶标抗体稀释倍数为1:10 000;0.05 M pH9.6的碳酸盐缓冲液为包被液;5%脱脂奶粉为封闭液;5%脱脂奶为样品稀释液;待检血清和酶标二抗反应时间分别为60 min和45 min,底物反应时间10 min。特异性实验表明,建立的IBV5b-ELISA抗体检测方法对禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(ND)、K亚型禽白血病(ALV-K)无交叉反应。重复性实验表明,该方法的变异系数均小于5%。以非结构蛋白5b作为包被抗原,成本低。本方法具有方便快捷、敏感性高、特异性好等优点,为IBV监测、流行病学调查及对IBV的疾病净化提供了一种新的有效的检测手段。