【摘 要】
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在杆状病毒表达系统中,多角体基因启动子在调控外源基因表达方面起了至关重要的作用。但其高效转录及调控机制到目前为止还不是很清楚。本研究以家蚕杆状病毒(BmNPV)为研究对
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在杆状病毒表达系统中,多角体基因启动子在调控外源基因表达方面起了至关重要的作用。但其高效转录及调控机制到目前为止还不是很清楚。本研究以家蚕杆状病毒(BmNPV)为研究对象,利用酵母单杂交技术筛选其多角体基因高效转录过程中与启动子序列相互作用的结合蛋白。通过提取感染BmNPV第5天的家蚕五龄幼虫脂肪体组织的总RNA,利用RT-PCR技术建立了家蚕五龄幼虫组织的基因表达文库,同时设计并合成了用于调控因子筛选的多角体基因启动子核心序列,采用酵母单杂交系统从构建的家蚕脂肪体组织cDNA文库中筛选与该核心启动子序列相互作用的蛋白因子。经过多轮筛选后,共获得12个阳性克隆仍保持AbA抗性,提取相应酵母菌单克隆中的质粒进行测序分析,发现它们分别属于3个不同蛋白的cDNA克隆。进一步对筛选出的cDNA序列进行生物信息学分析,发现它们分别编码宿主来源的核糖体蛋白RPSA (ribosome protein derived, RPSA)、核糖体蛋白RPL5 (ribosome protein derived, RPL5)和核型多角体病毒DNA结合蛋白(DBP)。为进一步验证筛选出的蛋白因子RPSA和DBP对多角体基因启动子活性的影响,分别将RPSA和DBP基因插入瞬时表达载体pSK-IE中,转染BmN细胞,24 h后感染重组病毒Bacmid-Luc,然后检测荧光素酶的表达量。结果表明RPSA蛋白和DBP蛋白对多角体基因转录均具有正调控作用。RNAi检测结果表明.RPSA和DBP干扰后对多角体基因转录水平均具有下调作用。本研究工作从分子水平探索了多角体基因启动子高效转录、表达的作用机制,为今后深入研究杆状病毒启动子转录机制提供了新基础。
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